※ 引述《reiosea (reiosea)》之銘言：
: 不好意思我表達不好
: 我想做的是把這個蛋白質重組出來，然後用Phage display找出有鍵結能力的peptide
: 我想找出可以有潛力去抑制這個化學感受器功能的peptides。
: 所以我只需要他露在細胞膜外的結構，而不要求其功能。
: 但是我現在卡在似乎這蛋白為unsoluble protein.
: 我怕說在做重組時這個蛋白會很難分離純化。
: 那我想說是不是可以只把它soluble的部份做重組就好（當然這個部位必須是在細菌膜
: 外）。
: 我想問的是這樣的方法可行嗎？
: 再來是我該如何去找出這個蛋白質哪一段是可溶哪段是不可溶。
: 我去跑TMHMM發現這個蛋白質都是在膜外。
: 這意味著她其實為可溶性？
: 可以以此為依據嗎？
終於看懂你的問題.
你其實是要做 phage display 的 bait protein, 但這個protein 可能是unsoluble,
不知道是否可以純化.所以, 你想只表現可溶的部份.
問題來了, 你如何知道那些片段是可溶的呢？
再來, 你只表現某部份的 extracellular domain片段, 你確定他的立體結構會是一樣
的嗎？事實上, 是很大的可能會不一樣的. 如此一來, 你用 phage display 釣出來的
的peptide 序列就根本是不正確的. 也就是說這樣部份片段所表現出的結構, 在自然情況
下根本是不存在的.
蛋白質在膜外或膜內和表達之後可溶與不可溶是沒有一定的關係的.
你的問題是表現蛋白時產物是insoluble, 這其實有很多方法可以去改善.
而且, 看起來你根本就還沒做表現, 怎麼就預設立場認為他一定會做出 insoluble.
我的建議是,
1. 如果經費許可, 且有commercial的recombinant protein可選擇, 你可以直接購買
來當你的bait, 即使是full length的也無所謂.因為, 如果你沒有做過protein
expression的經驗, 這裡會遇到很多阻礙.況且, 後面也還會有其他問題,
不用浪費時間在這個步驟上.
2. 如果一定要自己做recombinant protein, 那建議你就是以不同的expression vector
來表現 extracellular domain 的整段protein, 這樣才能維持立體結構的正確.
3. 個人比較建議你用 GST-Tag 來表現你的ECD protein, protein purity會較好,
畢竟是要當bait, 總不希望釣到其他雜蛋白. 至於, 萬一真的遇到insoluble的問題,
也是有方法可改善的, 不用太care那部份, 正確的實驗設計才會有可能有正確的結果.
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