Re: [求救] PCR結果定序出來的序列不是我要的!!

[runpapa0520 (PAPA)]

首先要問你pcr產物多長


跟你預設的結果長度相同嗎? 不同也不用玩了






通常>500bp以上，會建議送2端去定序 (因為一般極限為7-800bp)

forward primer 訂序結果直接用

reverse primer 定序結果要先reverse & complement

通常中間會有重複的 可以合併起來

如果長度適當  forward primer的結果會看到 reverse primer 的序列

              reverse primer定序結果會看到 forward primer 的序列


互相比對一下就可以得到全長了

ps 如果產物很長 可以在中間加一primer去訂序


通常都是接到vector上後再用vector上已知的primer去定序，

這樣才能看到pcr用的primer序列。



假如這樣你都比不出來 我只能說

你真的pcr到路人甲了，primer特異性不夠。









※ 引述《mini188 (迷你邀霸罷)》之銘言：
各位好

我之前PCR跑出一段序列後 送去定序

我將原來primer和定序結果blast 但是沒有相似的地方

於是我將序列reverse   也不行

    我又將序列 reverse & complement 也不行

用了forward 和 reverse的 primer 都沒對到

定序的PEAK很漂亮沒問題

那請問各位 為啥之前我的PCR可以做出很shape的band?

annealing temp 是60度 應該不至於會有non-specific的問題吧?

不知道是定序方面出問題還是我的PCR出問題

但若是PCR有問題 那之前跑出的band是什麼東東??

不知道大家有什麼想法??    謝謝!

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◆ From: 203.64.247.5
推 jademan:那到底整段sequence是你要的東西嗎?
推 tsubasawolfy:對看看有沒有vector的sequence....
推 bider:要不要用RE check片斷大小是否正確
推 kemp6611:DNA直接跑PCR，primer後面20-30bp無法定序出來~是正常的!
→ kemp6611:所以做DNA比對~當然是不可能比對到primer序列...
→ kemp6611:做cloning才有可能得到完整的DNA序列
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◆ From: 118.167.26.116
推 egoweaver:推PCR到路人甲XDD 這串的原PO有試過直接把定序結果拿去
→ egoweaver:NCBI BLAST看看是誰嗎？