[求救] A549 cell的trnasfection

[g010377 ()]

我是用invitrogen的lipofectamine 2000

在6cm dish中做transfection

條件:

A549 cell confluency>90%

lipofectamine reagent 20ul

pCMV-HA tag-insert cDNA 約10.4kb

送入8ug (8ul, 260/280=1.87)

DMEM+DNA 8ul ->RT 5min
                         -----> mix RT 20min 慢慢滴入細胞
DMEM+reagent 20ul ->RT 5min

在sreum- and P/S-free 的DMEM中進行transfection


5hr 及 24hr之後換成含serum的medium


換medium後的14hr harvest cell

做western blotting detect HA-tag

都沒有detect到東西= =

有沒有板友可以給些建議

萬分感謝

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 211.76.175.170
推 aceliang:>90%不會太多嘛？ 是沒用過lipofectamine，不過14hrs不會
→ aceliang:太短嘛？另外A549本身轉染效率就不大好。
→ g010377:guideline的建議是90~95%  我也有想過14hr是不是太短
→ g010377:但如果有送進去的話 有CMV應該14hr就足夠表現我要的東西
推 turtle24:用3T3當positive cell看看送不送得進去
推 kaifish:A549的transfection efficiency不太好喔...
推 leoblack:A549真的不好transfection,反而黴漿菌污染後效率變好~囧
→ tyh0104:use OptiMEM?