作者aggaci (超好看的篤姬!)
看板Biotech
標題Re: [求救] western的internal control 調不勻
時間Tue Nov 10 11:47:59 2009
※ 引述《katty7389 (被風吹跑了~)》之銘言：
: 大家好我是做western blotting的新手
: 最近實驗遇到瓶頸.想請大家幫忙
: 最近我在做KB跟L30 protein的表現
: 可是發現每次壓出來的internal control都不均勻
: (我有分fraction, cytoplasm是壓b-tubulin. nucleus是壓lamin B)
: 我猜想幾個可能造成的原因
: 1.收細胞時,medium去除不乾淨 影響定量的結果
: 2.收細胞時 兩個細胞收的量不太一樣 影響定量結果
: 3.因為我把sample跟sample buffer加在一起之後去加熱.在loading到SDS-PAGE
: 時發現體積會比原本兩者混在一起的體積還少.我覺得自己使用pipette的技術
: 沒有問題.我在想會不會是這個環節有問題
loading前用小烏龜稍微離心一下即可，internal control不均勻應該不是這個問題
: 因為只是猜測 不確定是哪邊出了問題
: 不過因為問題沒有解決 我有點害怕進行下一個實驗 所以想請大家幫我看看
: 這邊附上我收細胞到loading sample的流程 請大家幫我指正
: １。用trypsin打下細胞。離心１２０００rpm 去除medium再用PBS wash一次
: ２。離心 去除PBS
: 3.用０.4M LYSIS buffer I與cell pellet mix
: ４。on ice 15 min
: 5.加入10%np40 votex後離心13000rpm 取上清液即為cytoplasmic extract
: 6.加入lysis buffer II與cell pellet mix
: ７。１５分鐘內 約每１分鐘vortex １０秒
: ８。離心13000rpm 取上清液即為nucleus extract
: 9.將取得的sample做定量
: １０。定量的結果假設為２.４１μg/μl,我每個well想loading 40μg.就加
: １６。５μl的sample與４μl ６x的sample buffer混勻(無論多少sample
:
: 都加４μl的sample buffer)
這裡有補水至相同體積吧？
: 11.100度煮protein 10分鐘
: １２。loading sample
定量時的標準曲線的R square是否大於0.995?是否有blank?
: 有錯麻煩大家指正 謝謝
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◆ From: 140.116.253.186
※ 編輯: aggaci 來自: 140.116.253.186 (11/10 11:48)
→ DFS:對了 借問一下補水到底有什麼影響嗎?有的實驗室都不補水耶 11/10 12:48
→ DFS:不是只要每well的sample量一樣即可? 體積會影響跑膠的結果嗎? 11/10 12:49
推 tsubasawolfy:補水是為了sample buffer的倍數吧? 11/10 13:40
推 katty7389:不,我沒有補水 實驗是有些學長直接用6xdye補體積 11/10 14:26
→ katty7389:我也想知道體積會不會影響跑膠結果 我的band都歪歪的 11/10 14:28
→ katty7389:我有設Blank r值也有大於0.995 11/10 14:29
→ ordinary07:你有測你lysis buffer會不會影響定量結果嗎 11/10 16:22
→ ordinary07:體積會影響跑得結果阿 看就知道拉 體積小的會被壓 11/10 16:23
→ ordinary07:還有應該是加 1Xdye(用lysis buffer稀釋)比較合理 XD 11/10 16:24
→ ordinary07:當然如果加其他東西跑得出漂亮的結果就好 11/10 16:25
推 bider:你取sample時 tip會插入液面下太多嗎? 11/11 00:02
→ katty7389:取溶液的中間 不過取完我都會盡量把TIP多餘的液體迴掉 11/11 00:26
→ katty7389:tip周邊沾到的液體 11/11 00:27