[求救] 請教ㄧ些關於跑flow protocol 的問題~~

[mzac1b (Goodday)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題

           ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----



我買了一些抗體如這支
Fluorescein isothiocyanate (FITC) anti-mouse/human CD44 (Pgp-1, Ly-24)
http://www.ebioscience.com/ebioscience/specs/antibody_11/11-0441.htm
要分析一些貼附細胞, 其中 CD44+ 佔所有細胞的比率

我去找了一篇文章想參考其ptrotocol
Transplantation of adipose-derived stem cells overexpressing hHGF
into cardiac tissue
Biochemical and Biophysical Research Communications 379 (2009) 1084–1090

其大略protocol 如下:

1. 10^5 cells were resuspended in 200ul PBS containing 0.5% BSA
   (bovine serum albumin)

2. incubated 30 mins at 4度 with fluorescence-labelded antibodies
   against CD44

3. After washing with PBS with BSA 3 times, the cells were suspended
   in PBS and analyzed by flow cytometry


由於我之前沒做過flow 分析, 我這邊ㄧ時也找不到人問
心中有許多疑問
想請問眾先進們~~

1. 我參考那篇文章的protocol, ok 嗎?

2. 為什麼它的PBS要加5%BSA? 不加的話會有影響嗎?

3. 有的protocol 還會在PBS 加 Ca+2 or Mg+2
   為什麼? 有需要嗎?

4. 為什麼有的protocol 說要用staining buffer? 如下這個protocol
   http://www.imgenex.com/getfile.php?manual_id=42
   staining buffer 有差嗎? 有需要嗎?

5. 如果flow 讀得到螢光值 (如FITC 的螢光)
   螢光顯微鏡看得到嗎?
   我是說會不會 flow 讀出差異, 但在一般螢光顯微鏡弱到看不到?


感謝指教~~



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 192.192.93.58
→ missoul:通常添加albumin Ca2+ Mg2+有維持細胞活性的目的
→ missoul:或許跟上機的細胞是否死的有關 或者維持細胞的原型吧(?)
推 purineboy:如果你的螢光強度在10^2以上，螢光顯微鏡可以看到
→ purineboy:有些staining buffer其實就是PBS(or T)+ blocking serum
→ kotenka:我的染色buffer都沒有加BSA，因為染色時間沒有很長，有些
→ kotenka:marker要染兩三個小時的話我就會加BSA；鈣和鎂是一直都
→ kotenka:加。FITC應該是看得到不過可能很弱或容易quench
→ kotenka:第二行打錯，鈣和鎂從來都 不 加