[求救] clone不出來

[jck0406 (jck)]

最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見
以下是我做clone的步驟

1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp)

DDW               36.5
10X buffer         5
dNTPs              4
Primer-R           1.5
Primer-F           1.5
DNA polymerase     0.5


94度       10分
94度        1分
58度       40秒
72度        2分
72度        8分

重複30個cycle

2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND
  clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。
  http://ppt.cc/w7Oi

3) gel extraction

4) 切RE

10X buffer         6 ul
DNA               52 ul
BamHI              1.5 ul
EcoRI              1.5 ul

作用37度，3小時

5) clean up後再跑電泳
   http://ppt.cc/SXMh

6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high )

vector         4 ul
DNA            6 ul
ligation kit  10 ul

7) clean up

8) Tansformation:

先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml)
http://ppt.cc/picw
http://ppt.cc/yElL

9)之後我再挑菌，培養O/N

10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND

http://ppt.cc/rTvE
http://ppt.cc/ztTE


如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津
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另外我還想補充幾個問題：

a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去
   最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？

b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說
   切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。
   我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。

c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分，
   冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。

d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功，
   那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢?

麻煩大家了，謝謝:D

                                                               clone新手留






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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 59.120.120.118
推 aceliang:a)沒差，會loss b)我都冰-20 c)影響不大 d)self ligation
→ jck0406:謝謝~ :)
→ foxrose:那就先TA cloning 再切insert出來 接到原本想接的vector
→ foxrose:就算很多band TA之後就挑很多clone 總會有對的吧 (by seq)
推 ksn:plasmid用enzyme雙切看1kb band有沒有出來。PCR primer本來就
→ ksn:夾不出single band了，用來check plasmid感覺不好用@ @
→ ksn:或是單切plasmid看大小有沒有比vector only大1kb，若都沒有，
→ ksn:再考慮上面實驗的問題
→ jck0406:不好意思，想請問K大，PCR primer夾不出single band。
→ jck0406:是什麼意思阿?
→ ksn:唔..抱歉~習慣用語 意思是指PCR產物跑膠會產生很多條band
→ ksn:文章開頭因為多條band必須進行gel extraction，若用相同primer
→ ksn:及條件進行最後plasmid確認的話，認為不太能確定有沒有成功~
→ ksn:這邊只是開頭想先確認 是PCR的問題 還是 clone 方式的問題