Re: [求救] clone不出來

[sancra (Lab Pub Orz...)]

※ 引述《jck0406 (jck)》之銘言：
: 最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見
: 以下是我做clone的步驟
: 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp)
: DDW               36.5
: 10X buffer         5
: dNTPs              4
: Primer-R           1.5
: Primer-F           1.5
: DNA polymerase     0.5

如果可以，dNTPs與primer濃度能不能寫一下
還有可能是我比較龜毛，不過你的總體積加起來不到50...
primer量太多，non-specific的機率也可能增加
可能試試看改變一下濃度

: 94度       10分
: 94度        1分
: 58度       40秒
: 72度        2分
: 72度        8分
: 重複30個cycle

58度確定是最適溫度嗎，可以試著跑gradient
看看較高的Tm下，non-specific band能不能減低
另外72度2分，對1kb來說好像真得太久了
最後那個8分也很長


然後我們老師之前告訴我們
做實驗不要存僥倖心理
所以在PCR condition還沒調到最好之前
建議你之後的步驟都別在做了
這種by chance的狀態下，就算真的成功也很難被認可

一點小建議，請參考看看

: 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND
:   clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。
:   http://ppt.cc/w7Oi
: 3) gel extraction
: 4) 切RE
: 10X buffer         6 ul
: DNA               52 ul
: BamHI              1.5 ul
: EcoRI              1.5 ul
: 作用37度，3小時
: 5) clean up後再跑電泳
:    http://ppt.cc/SXMh
: 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high )
: vector         4 ul
: DNA            6 ul
: ligation kit  10 ul
: 7) clean up
: 8) Tansformation:
: 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml)
: http://ppt.cc/picw
: http://ppt.cc/yElL
: 9)之後我再挑菌，培養O/N
: 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND
: http://ppt.cc/rTvE
: http://ppt.cc/ztTE
: 如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津
: ------------------------------------------------------------
: 另外我還想補充幾個問題：
: a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去
:    最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？
: b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說
:    切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。
:    我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。
: c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分，
:    冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。
: d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功，
:    那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢?
: 麻煩大家了，謝謝:D
:                                                                clone新手留


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◆ From: 125.230.194.4
→ saviora:他的pcr會沒50大概是因為沒寫入dna加的量
→ saviora:至於extend step長度就看他的enzyme來決定
推 jck0406:對，我忘了寫DNA的量，拍謝。謝謝你給我的意見 :D
推 yaliu:我也覺得你的PCR條件可能要再抓一下，雜band有點過多
→ yaliu:如果找不到適合條件，可以自己重設拉～～
推 yaliu:ligation後可以不用clean up，請問你ligation作用溫度時間？
→ yaliu:另外，你抽質體後是用什麼primer作PCR?insert or vector?
→ yaliu:可以用vector的P看看insert大小，另外也可以RE看看大小
推 jck0406:ligation 16度 O/N ，抽完plasmid是用insert得primer
→ jck0406:謝謝哦～!
推 yaliu:我覺得你的問題可能在clone部份，primer雖不好但也是可以做
→ yaliu:因為你是直接拿PCR純化過產物RE，或許此步驟可以改先
→ yaliu:做TA cloning，之後在用酵素將insert切下與vector黏合
→ yaliu:這樣雖然比較花時間，但成功率比較高