[求救] AT-rich PCR 無產物

[blueashin (tRoMboNe pLaYer)]

想請問各位高手

我要擴增一段DNA片段
前提是這組primer用於擴增該基因的cDNA是沒有問題的
但是不知道為什麼 用來擴增DNA的時候 卻怎麼放都放不出來
於是我分段來擴增這個基因
沒想到分成兩段來擴增 居然可以擴增出來

問題來了 我試圖把兩段用RE切斷然後接在一起
再進行全長DNA擴增
沒想到 依然失敗
後來把兩段分別定序 確定是該基因沒錯
也發現它的AT content大概是70%

google了一下發現大家都用降低extesion溫度 以及拉長extension時間來擴增這樣的片段
於是我做了extesion temperature的gradient pcr
發現在extesion temperature=56時 有我要的產物
但我想再重複
卻又不見了
QQ

實在很苦惱 不知道有沒有人遇過這樣的事情

感恩~

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 210.241.123.131
→ puec2:Google:  Betaine DMSO
→ blueashin:恩...我想 這兩樣是高GC比的時後在用的吧?
推 singren:條件多試一下吧~總有做出來的時候XD"
→ blueashin:~.~"謝謝你的鼓勵~
→ bobbygau:最近也是在做一段AT-rich基因的擴增，一直P不出來，直到
→ bobbygau:試了瑞林生技代理的KAPA HIFI，超讚，他們有試用品。
→ blueashin:喔喔 請問 南部有代理商嗎?
→ blueashin:我目前用的是clontech advantage2已經是很敏感的酵素了
→ blueashin:不過當然有時候過於敏感的酵素會有反效果
→ blueashin:謝謝你提供的資訊 我會試試看^^