[求救] 請問各位'

[uokoperfect (病態)]

假設今天P了兩段PCR產物

兩段PCR產物5'跟3'各有100多個mer重複
A產物

5'--------------------------3'
3'--------------------------5'
                    5'-----------------------------3'
                    3'-----------------------------5' B產物

如何把它們結合成一個完整的序列了(因為這個基因全長我抓不到條件 所以p成兩段)

一樣用pcr的方法嗎

先加熱再結合 再延長?

我有點不懂為什麼博士要klenow fragment來做

直接用taq 不行嗎

請各位幫我解決

謝謝

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 60.249.152.174
推 TOTO:這個應該直接用一般pcr方法做吧，省去94'C 3min這個第一步
推 ookubo:A產物forward + B產物reverse primers 用PCR就好了
→ ookubo:用pfu是為了降低一般Taq的錯誤率
→ nike77114:樓上他用的是klenow fragment跟pfu有啥關係= =?
→ nike77114:klenow fragment的特性是5'-3' polymerase activity
→ nike77114:3' → 5’ exonuclease 這樣原PO大概知道為啥要用
→ nike77114:klenow fragment了吧@@?
→ nike77114:只是我如果沒記錯的話好像要控制好klenow fragment
→ nike77114:維持兩種活性的平衡= =不然做出來又被吃掉
但是整個實驗 我應該沒有要用到3' → 5’ exonuclease阿
因為我是要這個基因的全長
3' → 5’ exonuclease 是要減少複製的錯誤率吧
這樣應該可以選用 有proofreading的 taq就好 不是嗎?
否則選要 kleonow 還要控制溫度....
不是多此一舉嗎?
還是各位有別的看法
因為我對klenow這個酵素的用處真的不太熟悉

假如要延長的話
是先讓兩股分開
然後彼此的重複的地方會粘上
那這樣tm值要怎麼控制呢
因為我沒做過類似這樣的實驗
希望大家幫忙解惑一下
※ 編輯: uokoperfect     來自: 124.9.207.51         (01/23 00:51)