Re: [求救] clone不出來

[uokoperfect (病態)]

※ 引述《jck0406 (jck)》之銘言：
: 最近clone一直出問題，所以想上來問一下大家的意見
: 以下是我做clone的步驟
: 1) PCR增幅出目標基因(約1000 bp)
: DDW               36.5
: 10X buffer         5
: dNTPs              4
: Primer-R           1.5
: Primer-F           1.5
: DNA polymerase     0.5
: 94度       10分
: 94度        1分
: 58度       40秒
: 72度        2分
: 72度        8分
: 重複30個cycle
: 2)跑 2% agarose gel ，因為之前一直跑出很多條BAND
:   clean up都無法清除，所以這次打算直接切膠。
:   http://ppt.cc/w7Oi
: 3) gel extraction
: 4) 切RE
: 10X buffer         6 ul
: DNA               52 ul
: BamHI              1.5 ul
: EcoRI              1.5 ul
: 作用37度，3小時
: 5) clean up後再跑電泳
:    http://ppt.cc/SXMh
: 6) ligation (kit: TOYOBO 的 ligation high )
: vector         4 ul
: DNA            6 ul
: ligation kit  10 ul
: 7) clean up
: 8) Tansformation:
: 先冰上10分鐘，HEAT-SHOCK 90sec 42度，在冰上2分鐘，塗盤 O/N(LB agar Amp 50mg/ml)
: http://ppt.cc/picw
: http://ppt.cc/yElL
: 9)之後我再挑菌，培養O/N
: 10) 抽plasmid，PCR，2% agarose gel，結果怎麼跑出很多條BAND
: http://ppt.cc/rTvE
: http://ppt.cc/ztTE
: 如果還要什麼資料我會儘快補上，希望大家可以指點迷津
: ------------------------------------------------------------
: 另外我還想補充幾個問題：
: a) 在步驟 7) ，我們實驗室的人說不用clean up，可是我不小心給他做下去
:    最後是用TE buffer elute下來，不知道對transformation會不會有影響？
: b) 切過酵素的DNA不能存在-20度C嗎? 因為我後來有做幾次，還是失敗，後來他們說
:    切過酵素的DNA不能冰-20，要冰4度，否則sticky end的單股部份會斷掉。
:    我大概冰了2-3天不知道有沒有影響。
: c) 我在ligation的部分，vector是用學姊之前切過酵素多的部分，
:    冰在4度C約一個星期多，不知道有沒有影響。
: d) 因為我transformation後有長菌，這樣不是代表clone有成功，
:    那為什麼後來抽plasmid跑PCR會什麼還是沒有我要的東西呢?
: 麻煩大家了，謝謝:D
:                                                                clone新手留
最近也在PCR

本來先試一般的taq 條件抓到以後

條件轉到有proofreading的酵素

怎麼p都很多band 而且忘記做cotrol

後來做control 發現 control也是很多band

後來抓到 是buffer污染了

我沒看到你pcr有做control組 不知道你有沒有確定沒有污染


假設你確定沒有污染的話....

你應該是在pcr的時候 把條件抓到有singleband 再往下做比較好

還是primer要不要重新設計一下 是不是專一性不夠


如果真的都不是上述問題

你要不要把切酵素的時間縮短

然後分開切 ECOR I一小時 做CLEAN UP 然後 XHO I 一小時 CLEAN UP

ECOR I 頗強 搞不好會亂切

但理論上來說 你有切STICKY END 在接上VECTOR

除了 VECTOR當初沒切到 自己接回去

其他的 都要有ECORI 跟 XHO I的切位 才能接上 VECTOR



我覺得污染的可能性頗高





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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 124.9.200.42
推 bluecsky:個人經驗 : re的buffer跟BSA如果保存不好 也會切不好
→ bluecsky:或是亂切 至於怕單切的話 其實加一步CIP處理就能做一個
→ bluecsky:不錯的保證動作 單切再自接得機率會小很多
推 jck0406:謝謝喔~不過PCR的 buffer只有我跑出來會很多條BAND。
推 jck0406:請問EcoRI頗強，這句話是指同樣都是1 unit
→ jck0406:EcoRI會比BamHI還強嗎?
推 liuse:是說EcoR1有star activity    放久or濃度太高  可能亂切
推 yaliu:EcoRI很便宜，但我拿它做實驗常有不知名的問題產生
→ yaliu:所以其實我不喜歡設這個切點...
推 jck0406:後來clone出來了，發現是gDNA汙染...