※ 引述《wayne841503 (JPG)》之銘言：
: 因為最近要幫老師做專題遇到了一些問題...
: 有蠻多不懂的地方想請教一下板友
: 就是該實驗最後要用real time PCR 去定量看gene的表現量
: 而事前要將抽RNA後轉成cDNA 再拿cDNA去做real time
: 我們實驗室是用Trizol去抽...
: 照理說抽出來的應該是細胞內所有的RNA (包含mRNA rRNA)
: 而後用OligodT去轉cDNA ←應該是所有細胞中的mRNA都會被轉成cDNA對吧?
: 之後就將cDNA拿去用待測gene的primer去夾用PCR放大
: 因為目前還不知道要挑哪些gene出來測
: 所以我們BOSS是說
: 先把RNA抽出送去做PCR array再從中挑幾個用real time去檢測是否符合
: 我們BOSS說每個濃度只要做一管轉成cDNA就好
: 之後的real time都可以用那管去做
: 我的疑問是...今天待測基因約有5個
: 而且要做3重複 如果都從那管有整個細胞的mRNA轉成的cDNA取出 應該會不夠
: 那如果要將該管cDNA用PCR放大
: 那primer要怎麼辦? 因為你不知道那管cDNA的組成 那你要怎麼去放大全部的片段?
RT-PCR用oligo dT作為primer 用Impron II RT enzyme
1 ug就可轉成20ul的cDNA 做real-time更省 只要10ng左右的cDNA就夠了
可以做Ｎ次 你的濃度很高 應該不會不夠
: 還有一個問題...就是我可以先把加藥處理完的細胞都抽RNA轉成cDNA
: 那以後就可以不用再養細胞 而只要從那管cDNA去做就好 這樣嗎 ??
: 這是第一次做PCR所以有很都不懂的地方...請大家幫忙看一下是否觀念有錯
: 謝謝^^
你可以都從那管cDNA來做就好 可是不擔心這樣沒有重覆性嗎？
要測五種gene不擔心剛好只有那次的實驗有這樣的現象嗎？
如果是我，我會再多做幾次細胞實驗，來confirm :)
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