[求救] transformation的問題

[syming ( )]

請問一下各位大大
小弟我最近作transformation有遇到一些問題
這實驗在重複實驗下 一只出現相同的問題
就是我將vector(pet21b≒5 kb) + insert (≒0.6 kb)載入competent cell (DH5a)

塗plate overnight 只有一個colony 然後我在去挖出來LB培養
之後有再用抽取plasmid 確定是否有ligation成功
可是跑出來的電泳膠片(0.7%) 只有約3 kb

insert 來源從膠片回收與 PCR得到 insert 電泳測試皆為0.6kb
最後都得到的plasmid結果band (3kb)
若是vector沒切乾淨的話 應該至少也要有5.X kb吧?!


已經卡關卡了好久都是一樣的結果
所以想要請問各位前輩
是我的plasmid 不適合DH5a嗎?


謝謝

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.113.77.200
※ 編輯: syming          來自: 140.113.77.200       (02/07 15:32)
※ 編輯: syming          來自: 140.113.77.200       (02/07 15:34)
推 kaifish:建議先linearize plasmid後，再估計大小會比較準確
→ syming:如果沒有linearize的話 不是只會差1kb左右嗎?
※ 編輯: syming          來自: 140.113.77.200       (02/07 16:07)
→ bee921:我認為supercoil form程度不同 就會得到不同結果 建議切一
→ bee921:刀
推 licat:建議你去找附近cloning作得很順的人仔細討論你的實驗
→ licat:cloning失敗 每個步驟都可能有問題
→ licat:trouble shooting對新手來說蠻難的 別害羞直接去找人討論吧
推 inchew:其實也可以直接PCR來看 看circular form真的不準
推 icome:只有一個colony很有可能只是雜菌..