Re: [求救] pichia pastoris X-33 transformation

[littlelizard (專注)]

: ※ 引述《relaxsleep (火球連發~)》之銘言：
: 請問各位
: 我目前在做pPICZaC分別插入三段片段 轉殖到P. pastoris X-33
: 先使用PmeI去切線性質體(需要clean up嗎?)

我是用pPICZaA  宿主用 Pichia pastoris KM71H
用Sac I 去切 (如果用Bgl II轉型率會低很多)
大概就是切在 AOX promoter 本身上游的部分會比較好

:
: 升任細胞製作是培養3ml YPD overnight 30度 250rpm
24 h之後 OD600 = 12~13
: 在隔天取100ul接種到100ml YPD約八小時長到OD600 1.3~1.5 (時間會不會太短?)
接完之後OD600 = 0.15 比較好
大約6 h   OD600 = 1~2 (5*10^7 cells/mL)
不過我沒養過X-33可能時間有差
第一次做的話可以多取幾個時間點測OD
: 6000rpm離心去培養基
: 冰無菌水100ml重新懸浮5000 rpm離心
: 在使用50ml無菌水+4ml 1M sorbitol懸浮 5000rpm離心
: 在使用20ml 1M sorbitol懸浮 5000rpm離心
: 最後用200ul 1M sorbitol回溶得到勝任細胞

我用
3000 g 5 min 倒掉上清液
50 mL pre-treated buffer (10 mM Tris-HCl pH7.5, 10 mM DTT, 100 mM LiAc, 0.6 M sorbitol)
30度C 靜置 30 min  (這個每次做現配, DTT使用前再加)

1500 g 10 min 2mL sorbitol wash 共 3 次 (可以吸到 2 mL eppendorf比較好操作, 各 1 mL)
最後 500 uL 回溶 80 uL 一管 大概會有 10^10 cells/mL
:
: 再把切好的質體10ul+80ul勝任細胞混勻 冰上5分鐘
: 1500V 15uF 335電阻 電擊
1500 V 25 uF 200 omega
: 加入1ml 1M sorbitol放30度1.5小時
我靜置 1h
: 塗YPDS plate 100ug/ml Zeocin
250 uL 塗一片
可以先滅好一堆L型波棒  先吹乾 plate  會塗比較快
: 養兩天挑菌
: 抽genomic DNA
: 用5'AOX1 3'AOX1 primer PCR
: 95度4 min 1cycle; 94 60sec, 55 60sec, 72 150sec 34cycle; 72 10min 1 cycle
: 結果都只有P到菌體本身的AOX1 gene沒有轉入的基因
: 請問哪裡有問題
: 有研究的大大 幫忙指證一下 謝謝!

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◆ From: 140.129.35.106
※ 編輯: relaxsleep      來自: 140.129.35.106       (03/03 13:01)
→ BarryJones:建議以更高濃度的Zeocin進行篩菌~並將同一菌落點在不同
→ BarryJones:抗性的Zeocin上~選擇高抗性又長得大顆的菌株~以少量
→ BarryJones:誘導的方式判斷哪一個菌株會產生你要的蛋白質~
→ BarryJones:基本上以PCR方式確定~也行~但我之前也有發生P不到的事~
→ relaxsleep:濃度是依照invitrogen protocal建議用100的
→ relaxsleep:p不到不就代表沒送進去喔? 誘導的話後續步驟感覺蠻繁
→ relaxsleep:雜的 不知道有沒有快速篩選的方法 不然沒送進去誘導也
→ relaxsleep:是白做的感覺@@"
→ BarryJones:對~但是你可以增高抗生素濃度做進一步的篩選~提高選中
→ BarryJones:機率
→ BarryJones:但我曾經有做過P不到但誘導得出來的事~而且誘導得出來
→ BarryJones:才是重點阿!
→ BarryJones:不然你可以篩選高抗性的菌株再進一步去PCRㄝ行~
→ qumai:還是先誘導看看吧 有時候不一定P得出來 但是可以表現蛋白質
→ qumai:培養幾mL就夠了 如果擔心看不到的話 先做蛋白質沉澱再跑膠
→ relaxsleep:恩 謝謝 我有試過2000的 幾乎都會長 但是還是p不到@@
推 littlelizard:切完的質體要 clean up 我們都是先挑 300隻
→ littlelizard:然後再挑到5X抗性的plate 之後你可以選擇用試管小量
→ littlelizard:誘導然後跑PAGE 或者用 96孔盤養菌然後用ELISA篩菌
→ littlelizard:如果都做不出來可以分析一下 codon usage 最近發現很
→ littlelizard:多表現量很差都是跟 codon usage 有關 = =
→ relaxsleep:可以請問96孔盤養菌然後用ELISA篩菌的方法嗎 我沒用過
→ relaxsleep:這方法@@
我們家從轉形的plate挑300隻起來
一盤100隻
你可以自己先用 plate 畫圓形在紙上  然後畫格子  標好1~100
影印至少兩張  護貝  加上很小塊的泡棉在四個角落
就可以貼在 plate上  挑得很整齊
當然你想多挑或少挑也可以
Invitrogen 的書上是有 50個一盤的圖片你可以直接印來護貝

我會先挑到1X抗性的  也就是 100ug/mL
養兩三天之後
再全部挑到5X抗性的篩一次

因為雖然抗性好不見得表現量就好  可是表現量好的抗性一定好

然後你要注意挑的時候大家挑過去的菌要一樣多

5X 長完之後  就有兩種方法可以篩
一個是我比較愛用的  用試管小量培養
我會從3片各挑 9 9 10 共28隻
因為BioRad 系統小 well 的扣掉 Mr 可以有 14個well 一次可以跑兩片SDS-PAGE

另一種就是
你拿可以滅的96孔盤  不是ELISA用也不是一般定量protein用的
他是有蓋子的  哪家有賣我忘了  你可以打聽一下
然後自己用鋁箔紙做蓋子包住96孔盤
我會做兩層  然後上面用有色膠帶黏住兩邊讓他可以像開 tip 盒那樣打開
內層的鋁箔你可以每次做新的  就的就拿去外層用
兩層都蓋好之後  疊一疊用可以滅的塑膠袋包起來摺好拿去滅
烘乾之後再用

然後就是把菌用牙籤點進去
當然你要有可以滅的馬槽讓你用八爪加medium不然你會累死
我記得我們馬槽是訂做的  好像是手拉坯吧 = =
滅的時候就用市面上鮮奶加玉米脆片的那種組合包  他的瓶身跟蓋子是可以滅菌的
因為商品本身就是高溫高壓滅菌  那個盒子很好用
放馬槽剛好
點菌記得也要放 wild type 或者 negative control (轉空的 vector)
然後都弄好之後
他原本的上蓋(應該是壓克力做的吧  透明的)蓋在鋁箔蓋上面
壓克力的上蓋你可以酒精擦一擦之後先拿去照UV再用

把你的plate疊一疊
放在shaker上搖
就把類似試管架的那種鐵架  比較小比較扁的那種  倒過來放
然後用固定 incubator 放 shaker 四爪的那個圓盤去固定鐵架
再把疊好的plate綁在架子上  大概最多五片一疊
記得一定要綁好
然後就是每天誘導了

誘導完之後
就離心
有一種懸臂是可以放 96孔盤的
離完之後一樣吸上清液  直接加在 ELISA plate 上
當然你要先 coating 好你的抗體
然後就可以做 ELISA 了

有的人是酵素  所以就測活性
那不能測活性的蛋白就只能做ELISA  找相對量比較高的

喔對~250 rpm就好 300的話會把菌搖出來





最後

你可能會想說

96孔盤可以全都篩到可是好麻煩

說不定你們家沒有那種盤子  沒有定做的馬槽  沒有可以離96孔盤的懸臂

我自己是覺得真的很麻煩

而且如果是這樣子  他其實越靠中間的well越不容易搖起來  菌都會沉在下面

長不好表現量就不好了  也算是缺點

不過如果你家的 incubator 是可以讓轉盤傾斜大概20度吧那就不會搖不起來

所以我才會喜歡用試管篩

雖然量不多  可是我都是挑抗性最好的

試管表現完之後

我會從SDS-PAGE去判斷誰表現量高

再挑前五名用搖瓶再篩一次

因為搖瓶跟試管有差

試管表現量會比較好  而且看不太出來 protease 降解的情形

最後搖瓶篩完就只留兩隻  但只會用一隻啦  兩隻是保險  就做凍菌

凍菌最好一次做個很多  每次就拿一管來用  讓你每一批菌都一樣

我自己是覺得  雖然從300跳到28隻有點少  也有可能肉眼誤判

但是selection 就是這樣  挑到你要的就好了

如果他已經很不錯  就算有比他更好的幾隻被你遺漏但是也不重要了

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◆ From: 140.112.74.19
※ 編輯: littlelizard    來自: 140.112.74.19        (03/10 21:10)
推 qumai:推推~ 感謝詳細說明
推 relaxsleep:感謝 請問離心1500g不能完全離下來 上面就不要了嗎?
→ relaxsleep:說錯是3000g
→ relaxsleep:我都要到10000g才離的下來耶@@
推 inchew:推！正好需要如此詳細的說明～感謝感謝～！