推 leoblack:應該是protein量太高而擠壓變形,不然其實這還可以接受啊 03/17 21:36
推 liuse:我感覺是沒跑好，連上面你說正常的 我都覺得不太漂亮 03/17 22:04
→ liuse:而且整條lane 有點歪歪的 03/17 22:04
推 mobisrat:那不是protein 你的sample sup部分有汙染到其他東西 03/17 22:20
→ jck0406:to 3F，因為我目前實驗室的做法，就是會在破菌後 03/17 22:44
→ jck0406:直接用loading dye回溶，所以loading dye都會加很多。 03/17 22:45
→ jck0406:不像其他實驗室會依照比例2X or 6X稀釋。 03/17 22:46
→ jck0406:所以有可能是loading dye加太多嗎? 03/17 22:47
→ jck0406:不過這樣的話我sample沉澱的部分應該也會有W型的band阿XD! 03/17 22:48
推 Fourfish:蠻正常的啊 我做表現跑電泳 如果dye沒跳海還蠻常看到的 03/17 22:53
→ Fourfish:我都認為那只是dye的問題而已 XD 03/17 22:53
推 yaliu:基本上我覺得你的sample製備可能有問題，所以band歪歪的甚 03/17 23:11
→ yaliu:至有點smear。另外，你有無加IPTG皆會有那條band，所以那應 03/17 23:12
→ yaliu:該不是你的產物吧....還有想問一下，破菌後沉澱是什麼意思阿 03/17 23:13
→ yaliu:正常來說不都是看破菌後上清液的嗎? 03/17 23:14
→ licat:你可以多跑一個control, BL21[pPAL] 加IPTG induction 03/17 23:16
→ yaliu:破菌後用dye回溶?上清液是液體，怎麼回溶?難道回溶沉澱物? 03/17 23:17
→ licat:如果這樣還是有W的band 那它就一定不是你要的東西 03/17 23:17
→ yaliu:不是很了解你的意思耶 03/17 23:17
→ jck0406:to yaliu，破菌後會離心，因為怕有inclusion bod 03/17 23:23
→ jck0406:所以也會收集沉澱物，沉澱會直接用dye回溶 03/17 23:24
→ jck0406:謝謝licat給的意見。 03/17 23:28
推 yaliu:inclusion body 據說不是還要加尿素之類的嗎?我沒跑過啦 03/17 23:28
→ jck0406: inclusion bodies 03/17 23:30
→ jck0406:對阿，要純化要加尿素或其他的藥品讓蛋白質重新摺疊 03/17 23:31
推 tsubasawolfy:你的破菌單純分soluble跟unsoluble吧 03/17 23:35
→ tsubasawolfy:不過IB也是在unsoluble 煮一煮一樣出來 03/17 23:36
→ tsubasawolfy:另外要看你有沒有induction出來做個time course 03/17 23:37
→ tsubasawolfy:會比較容易找 03/17 23:37
→ jck0406:對，是分soluble & insoluble。可是不太懂你第二句? 03/17 23:38
推 tsubasawolfy:你的pellet用sample buffer回溶後也會煮吧? 03/17 23:40
→ jck0406:是指純化用加熱的方式讓他重新摺疊@@? 03/17 23:40
→ tsubasawolfy:這邊還不用探討到refolding...要先確定到底有沒有 03/17 23:41
→ jck0406:對，也會煮，不過我是過有煮和沒煮，結果一模一樣...>"< 03/17 23:41
→ tsubasawolfy:refolding要調的那些不同鹽類跟pH buffer是惡夢 03/17 23:42
推 tsubasawolfy:不然就放大絕用Urea破菌後過column看到底有沒有(如果 03/17 23:48
→ tsubasawolfy:老闆不介意的話XD) 03/17 23:48
推 kalfan1:W應該不是蛋白質 size也太小 03/18 04:15
→ kalfan1:這膠可能做的不好 所以marker也有點歪 不是sample的問題 03/18 04:16
推 bluecsky:單純loading太多 而且看起來你沒讓他跑跳海 03/18 06:31
→ bluecsky:還有看你沒切掉的部分 你stacking的距離有夠嗎? 03/18 06:33
→ bluecsky:不過W應該不是protein沒錯 可能問題在buffer中 03/18 06:35
推 iceking:同一個sample做western確認到底是不是那條band 03/18 10:40
→ iceking:另外inclusion body有自己的lysis方法,不要直接用dye回溶 03/18 10:41
推 iceking:另外w只出現在你的上清液,可見你上清液製備有問題 03/18 10:46
推 aeroufo:應該是protein沒有定量吧你看每條lane的量好像不一樣耶 03/18 15:53
→ NKTcell:可以試試看Tricine-SDS-PAGE 03/18 17:49
→ jck0406:謝謝NKTcell給的意見～ ^^ 03/18 20:57
推 psychehsu:W看起來不像是protein，而且都是出現在上清液的部份 03/19 01:16
→ psychehsu:會不會是上清液中含有鹽類等干擾物質而影響跑膠結果 03/19 01:19
推 psychehsu:檢查一下破菌的buffer~ 03/19 01:27
→ yangkoumi:你的樣品應該不太乾淨~ 03/19 19:38
推 StillRick:因為會反白，所以應該不是 protein 03/20 10:24
→ StillRick:因為band 有扭曲，可以知道某些樣品的鹽濃度相對過高 03/20 10:25
→ StillRick:因為只有上清有，所以覺得是菌液中的 salt or "小東西" 03/20 10:27
→ StillRick:建議是在染色前，可以先用 Q 水泡一下， 30min to 1hr 03/20 10:28
→ jck0406:謝謝各位~^^ 03/20 15:29