[求救] 請問將一段基因放入vector

[dodomilk (豆漿)]

各位好，我現在在化學實驗室工作，沒有分生專長的學長姐可以問

所以想請大家幫忙


我現在想在一個7k bp的E.coli vector中插入一段約60 bp的序列

大概是長這樣  ----T7 promotor-----intein---target protein-----
                               ↑
                               插在這裡

intein是作為affinity column純化時使用，約50kD的protein

原本的MCS在intein的下游，但在插入target protein時已經用掉

那麼我該怎麼把60 bp插到promotor和intein的中間呢？

目前想到的大概是

用Site-directed mutagenesis在想插入60 bp的地方，

先插入兩種restriction site，約12或15 bp，再用ligase接上去。

不過不曉得Site-directed mutagenesis有沒有辦法直接插入60 bp呢？


另外，我們手頭上其實沒有這60 bp的DNA，應該要怎麼製作出來呢？

我猜大概可以先請別人合成60 bp的RNA，再用RT-PCR作出DNA...這樣做可行嗎？


原PO非專家，兩個簡單問題請教大家

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 123.195.2.120
推 DJHINN:直接和成  DNA就好了  =  =
→ DJHINN:60bp  PCR做不出來  RT也有點浪費  且我也懷疑做不出來
→ DJHINN:找  和成引子的  公司 跟她說  你要合成  一段 60bp的引子
→ DJHINN:拿到之後  做a-tailing的實驗  在頭尾  +A
→ DJHINN:方便你insert進  VECTOR
→ DJHINN:另外  你的vector是自備的嗎?  還是  商業的
→ DJHINN:看起來應該是自備的，60bp : 6000 bP我覺得不好塞  這方面
→ DJHINN:可能要嘗試多次一點
→ DJHINN:你用限制酶切下來的片段，可能要用到3%左右的膠跑看看
推 DJHINN:關於  insert部分  我好像有點弄錯了  因為我把它當成一般
→ DJHINN:commercial 的 TA clone vector了  那部分  ....就算了吧