[求救] 有關gel extraction

[blueashin (tRoMboNe pLaYer)]

想請教板上的各位先進
最近我有一條基因想要送讀序
可是一直無法以gel extraction的方式成功回收
但是因為pcr的產物 量實在是無法增加
所以只能在gel extraction方面加強

以下是我gel extraction的步驟:我使用的是V牌國產的回收kit

切下膠塊以500ul GEX buffer回溶
60 度C加熱10分鐘 反轉2-3次
通入column用vocume method

WN buffer500ul

WS buffer 500ul

13000rpm 25度c離心3分鐘
加入預熱60度C之EB或者 ddH2O(pH=7)
等待10分鐘
13000rpm 25度C離心3分鐘
以上步驟 不知道到底是哪理出問題了QQ還是說是他們的column有問題?
我測OD值都很低 有時候還測不到東西
縱使有測到 A260/230的值也很低
要做ligation實在有困難QQ

以上 懇請各位指教~

--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 210.241.123.131
推 singren:不用做gel extraction也可以送定序吧..廠商好像會幫你做~
→ singren:需要的話在跟廠商要sample也可以呀~
推 tinapig:承1F說的,可以拿PCR產物純化後送定序,但有些老闆(師)不喜
→ tinapig:to原po:60度融解gel後,是否有先冷卻(至室溫)?有時若膠太大
→ tinapig:在60度全融,但回到室溫會又有點凝固,這樣回收率會很差~
→ tinapig:以上是我以前遇到的狀況~請加油:)
推 oh:treat exonulease I跟SAP~就可以直接送定序~
→ oh:      打錯是 exonuclease I
→ chaunen:不能一次P個好幾管 再去切交純化嗎@.@?
→ chaunen:我都是加熱30sec invert30sec 直到溶解 就放著等他涼
→ chaunen:可以的話用越少agarose越好 (1% LM agarose 真的很嫩=.=)
→ chaunen:沒看清楚原文, 直接拿PCR產物去定序就好了吧?
→ chaunen:不過這也只保證primer後的50bp~700bp 是可信的
→ chaunen:如果想要整個完整定序到的話, PCR產物直接接到T/A
→ chaunen:再抽plasmid去定序?
→ ksn:檢視一下protocol，WS buffer有無加入酒精，WS buff 離心完後
→ ksn:需要不加buffer全速空轉三分鐘去除WS的酒精成分
→ ksn:膠不要超過2%，總重在200mg較佳。切膠是盲切還是在X光台下?
→ ksn:我昏頭了XD 我是指UV光台 XD
→ ksn:預熱60度C回收大於5k片段時利用，小片段使用一般水2~3min即可
→ blueashin:喔喔喔 沒想到大家這麼熱心(感動中)請受小弟一拜~
→ blueashin:各位說的 我會注意看看~感恩感恩有任何消息我會回報~
→ blueashin:還有就是 因為我是做RACE-pcr所以 非單一產物
→ blueashin:所以要直接送 PCR產物可能不行QQ
→ blueashin:不過真的很感謝各位熱心的回應~感恩感恩
→ blueashin:切膠是在UV box上面切的
推 vetvet:如果是single band用Q牌的PCR purification kit吧!回收量差
→ vetvet:很多