[求救] ligation的產物降解了？

[dodomilk (豆漿)]

實驗步驟

將insert(600 bp)及vector(7500 bp)以SapI及XhoI做double-digestion

產物跑gel 有很明顯的band在正確的位置上 double-digetion應該是成功的

將切下來的兩塊gel(分別包含insert及vector 共約500 ul)混合並融化後

加入beta-agarase分解gel (0.5X TBE + 1% low-melting agarose)

直接加入T4 DNA ligase及buffer  16度下反應17小時

以上是按照vector建議的步驟做的


但ligation產物跑膠卻沒任何東西 insert vector 環狀DNA 都沒有

transformation也沒長出東西

猜想大概被降解了

問題會出現在哪個地方呢？

目前想到 有可能是ligation的環境不對 0.5X TBE 可能不適合反應

不然就是ligase壞掉了

請各位解答

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.114.44.41
推 micocat:ligation反應體積? transformation體積?
推 Fourfish:好酷的作法..第一次看到..應該是整個環境不對 太複雜了
推 icome:第一次看到+1 這樣做能做出來也很神...
→ icome:ligation你的insert和vector要夠乾淨 而且反應體積要小
→ icome:通常我只拿一點去跑膠算比例 剩下的clean up後再做ligation
→ dodomilk:反應體積就是切下來的gel的體積 約500ul
→ turtle24:我ligation體積只有15ul 原po跑膠看不到是不是根本太稀了
→ dodomilk:我試試clean up之後再ligation看看
→ ararthur:應該是太稀了啦 算一下你放多少DNA吧
推 conective:這是說直接把兩片膠溶在一起 之後直接作ligation?
→ Ianthegood:反應體積500 那enzyme加多少啊?
→ dodomilk:4ul
→ chaunen:太稀+1 何不通column? agarose也會影響到ligation