[求救] primer訂製出錯的可能性？

[dodomilk (豆漿)]

目前ligation遇到了瓶頸，交叉測試之後

認為問題所在可能是primer上RE認的位置及切位


所作的測試如下

兩種RE算過濃度後，各自單獨切vector，成功 => RE及buffer沒問題

被切一刀的vector作ligation，成功 => ligase及ligase buffer沒問題

competent cell使用vector作transformation測試，成功 => competent cell沒問題


現在能想到的可能性，只有在作insert的PCR時，所使用的primer有問題

RE認的位置或切位可能不對，造成RE根本沒切到insert

接下來應該會用TA cloning確認


請問有人碰過跟廠商訂primer時出錯的情況嗎？

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.114.44.46
→ skybreeze:之前有聽過有些廠商  合成primer會出錯
推 iceking:有可能,而且機率不算低
推 ROKEE:有, 遇過, 明X
→ dodomilk:我就是跟明X訂的...
推 bee921:遇過 我把定序檔給他們看 馬上重合一條給我 可以試看看
→ mzac1b:定序才能知道有沒有錯
→ mzac1b:我對明X 的經驗倒是沒遇過錯
推 sheepfeather:我也是明X...讓我多搞了快1個月 = =
推 icome:要定序才知道 insert本來就會比較難切 你有切比較久試試看嗎
推 tsubasawolfy:NEB有提供哪種enzyme需要oligo多幾個mer還有效率
→ tsubasawolfy:incubation的時間長短 所需的Unit
→ dodomilk:我用的是SapI及XhoI, primer在RE位置之前有多設計六個bp
→ dodomilk:也有按照DNA濃度加適量Unit的RE
→ chaunen:inser切完跑膠看一下有沒有東西吧
→ chaunen:說錯 是PCR完
→ dodomilk:有 PCR完我會切下正確長度的band作ligation
→ mzac1b:把你的PCR產物作TA cloning 然後再切 或拿去定序
→ dodomilk:嗯 我接下來就是要這樣做
推 bluecsky:本來就有可能出錯 確定出錯的話就馬上打去叫他們重做
推 icome:gel extration得到的產物會比較難接進去! 建議直接clean up
→ icome:根據某老闆的說法是 EtBr會影響ligation效率
→ chiasaiqueen:PCR extension時間沒給夠，兩端沒做完也會接不上。