[求救] competent cell製作

[dodomilk (豆漿)]

我們實驗室想作的是一種叫XL10-gold的E.coli, strategene的產品

因為有TetR基因, 所以我在養菌時加了Tet 20ug/ml

不過作出來的菌居然可以在有Amp的LB plate上長滿滿的...不是一顆顆, 是一整片

是不是有污染呢？

或者是有Tet抗性的菌會影響對Amp的抗性？(應該不會吧...)




大概說一下我的作的過程

從-80度冰箱挖一些XL10-gold, 種到含20 ug/ml Tet, 50 ml LB的錐形瓶, 37度隔夜

取200 ul culture, refresh到另一個含20 ug/ml Tet, 50 ml LB的錐形瓶

OD = 0.35的時候冰浴10 mins, 4000 rpm 轉 10 mins, 倒掉上清液

在冰上用12 ml過濾過的氯化鈣溶液(包含一些其他鹽類及甘油)resuspend

冰浴10 mins, 4000 rpm 轉 10 mins, 倒掉上清液

在冰上用4 ml氯化鈣溶液resuspend, 分裝, 每100 ul一管

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◆ From: 140.114.44.46
推 tsubasawolfy:他本身不會抗Amp...
→ tsubasawolfy:不然他附的pUC18 control不就附心酸的..
推 bigcat24:做過XL-Blue 本身不會抗Amp 看來是貴lab的stock 有問題~
推 snowypuppy:之前做competent cell有污染的時候也是長一整片怪東西
→ snowypuppy:如果用stock去塗盤看看有沒有污染呢?
→ snowypuppy:不然就重做一次吧～可能是做的過程中有污染問題
推 CakeCola:XL-10 gold可以自己做喔? 之前買一管1000多，超貴!
推 snowypuppy:competent cell都可以自己做呀～只是效率沒有買的好啦
→ chaunen:我都一次做2個紙盒說, Amp 20/ug/ml 不會有點少嗎@@?
→ chaunen:我是用50~100ug/ml
→ chaunen:這菌會長得比較快, 時間比DH5a少大概2hr吧
推 chaunen:我說XL-10 gold
→ chaunen:抱歉 我會錯意了
推 aeroufo:你塗盤有沒有塗乾壓，會不會是因為你的菌根本沒有乾也會長
→ aeroufo:成整盤都是菌，而不是一顆顆的菌，如果是一顆顆的那汙染了
→ aeroufo:就重新由頭開始試吧
推 jennychine:Ap很容易就會失效的~建議重配 加上plate也要50ug/ml
抱歉，後來再測試一次之後，認為應該是我把有作pUC18(含ampR) transformation

和沒作的搞混了...搞笑了，對不起...
※ 編輯: dodomilk        來自: 123.195.13.126       (06/04 19:11)