[求救] 請教關於製造病毒感染的問題

[mzac1b (Goodday)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題

           ----請將上列注意事項以 ctrl + k 刪除後開始編輯文章----




我在進行病毒製造與感染
用的是中研院RNAi core 的系統
http://rnai.genmed.sinica.edu.tw/Vector_Information_C6-6.asp

pMD.G
delta8.9
外加一個表現綠螢光的pGIPZ (lentiviral shRNAmir empty vector )


目前遇到的問題是感染率普通 (感染後三天流式細胞儀分析約 40%)
                           (有加polybrene, 加病毒液後有再離心1000g, 30mins)
但是螢光顯微鏡下可判讀的螢光約只有10%

於是想提高感染率
我的老闆提供的改良是:

1. 病毒液用2~3% FBS 之medium 去製造
   避免病毒製造細胞活力太旺培養液太黃
   影響titer

2. 病毒液感染後(加polybrene, 離心後)
   由於病毒已經沾粘細胞
   即可拋棄病毒液, 更換培養液 (一般protocol 似乎是泡在病毒液中一天)



然後我自己想的辦法就是增加感染次數
目前預計每12hr 感染一次,  比較感染1, 3, 6 次的感染率及螢光強度


關於我老闆說的改良方式
我沒試過聽起來毛毛的
想請問有經驗的人
對於我目前進行的這三種促進方案有沒建議意見
或是是否有其他有效的方案
感謝~



--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 210.60.122.14
推 aceliang:病毒做出來有測titer嘛？
→ mzac1b:沒有測 只有直接看螢光評估感染率
推 aceliang:重複感染我試過效果不太好，試試看超高速離心嘛？
→ soom:重複感染，我試過4小時換一批病毒液，效果還不錯
推 williamyang:產病毒的293T也會影響titer,請問是用293FT嗎？
推 icome:最有效的方法 濃縮 有貴桑桑的病毒濃縮試劑可買
→ icome:或用sucrose cushion高速離心 有點麻煩就是了
→ mzac1b:我是用293FT  因為怕麻煩 所以目前沒打算作超高速濃縮
推 icome:試試看細胞seeding的時候直接加病毒 隔天貼下去再換medium
推 robertkoch:俺是用HEK293T產病毒 俺是用高M.O.I.解決感染效率
→ robertkoch:大約會用到 M.O.I.=6
→ robertkoch:大約就是2X10^5細胞對上RNAiCore方法的病毒液2ml
→ robertkoch:6well的1100g0.5hr 96well的1100g2hr
→ robertkoch:都只感染2hr~3hr就換新的media
→ robertkoch:螢光隔天看會很弱 所以俺都是在收實驗時也就是第三天
→ robertkoch:才去拍螢光顯微鏡 大約可以觀察到8成以上的感染率
→ robertkoch:另外 目標細胞也會影響感染效率
→ robertkoch:btw俺用的RNAi抑制該基因後會導致生長緩慢所以不太會長
推 sweetE:是感染什麼細胞?
→ mzac1b:大鼠脂肪幹細胞
→ chaunen:請問..超高速離心時, 沒用sucrose墊在下面 會怎樣嗎?
推 icome:部分病毒會破掉 會損失掉一些
→ icome:脂肪幹細胞的話可能本來就不容易感染 MOI要高一點