[求救] Vector only 的 control 比 vector + insert 長得還多？

[boblu (六百)]

囧 cloning 真的不是我的強項 囧

手上有一個片段 (8xx bp) 已經以 TA cloning 放到 vector 裡面

要轉到另外一個 expression vector (pCS2+, 兩生類與魚類用的, 3xxx bp）

TA 中的 insert 是被 EcoRI and BamHI（皆為唯一）夾在中間

expression vector 上的 MCS 當然也是有這兩個 site

pCS2+ 跟 TA construct 同時作 double digest 以後

pCS2+ CIP 一小時（double digest 應該沒必要 CIP？想說有作有安心）

在 gel 上有看到 insert 被 release 出來

--> pCS2+ 的 double digest 應該也是成功的吧？

gel extract 以後，insert 跟 pCS2+ 各取 100ng（莫爾比大約3:1）作 ligation

control 就是用水代替 insert

用的是 Takara 的 kit 2.1

O/N 以後取一半的 ligation product 丟 Invitrogen 的 competent cell

結果：

vector only 的那一組長得比有 insert 的還多 囧

這種事發生不只一次了 實在已經想不出還漏了什麼？

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 131.212.202.90
→ relaxsleep:有沒有接上才是重點吧@@
→ senlin:1.兩者都有star activity  2.買新的CIP  3.換成SAP
1. NEB 書上的說法是說在我用的反應條件下不會有可偵測的 star activity

切完跑 gel 看起來也是沒有明顯的 star activity

又而且 vector only 也是用 double digest 過的啊

→ soom:會不會是competent cell的問題？(機率很低啦我知道)
用過兩批批號不同的 comptetent cell 加上自製的

→ boblu:長得比 control 少 根據過去的經驗有接上的機率低過百分之一
→ boblu:另外這個 vector 沒辦法作藍白篩選
有沒有可能只是作 gel extraction 切膠的時候還是帶到了 circular form 的 vector

因為跑膠的時候 band shift 的幅度沒有很大

只是這樣可以解是 vector only 為什麼長很多 卻無法解釋為什麼加了 inser 會變少啊？
（影響 circular form 被吃進去的比例？）
※ 編輯: boblu           來自: 131.212.202.90       (08/07 03:34)
→ boblu:修了文 推一下 請各位闆友再進來指導
推 mattmatt:請問double digest時間多久? 以及plasmid和RE的量?
37C 四個半小時, pCS2+ 用了 4ug, RE各1uL

→ mattmatt:ligation的溫度?
16C O/N
※ 編輯: boblu           來自: 71.10.75.57          (08/07 05:30)
→ tsubasawolfy:takara那組不是建議做bluntend才ON? 一般sticky 30
→ tsubasawolfy:min就可以長一堆  不過ligation再怎樣接不上去
→ tsubasawolfy:I+V那組應該也要長得跟V only一樣多..
→ tsubasawolfy:而且TA剪下來貼上新的這成功率跟羊入虎口沒兩樣..
→ tsubasawolfy:兩者做gel extraction後的品質呢?例如nanodrop顯示的
→ tsubasawolfy:全波長讀值曲線有沒有鹽類太高 酒精沒甩乾淨
這方面應該是沒有問題

Wash 以後都有照 protocol 甩兩次

nanodrop 看起來也還算正常（不過我不太知道到什麼程度才算是太？）

最後的 elute buffer 裡面有 tris,
不過 Takara 的 kit 說明書裡面說那個 kit 喜歡 tris...

推 liuse:這情況我還蠻常遇到的   CIP不是每次都很好
→ liuse:但只要ligation有長的  多挑一點就會挑到  所以建議原PO
→ liuse:就直接挑來check了吧
請問你的經驗多挑是要挑多少？

我這個 construct 已經好幾次挑三十個都沒有東西的

過去的習慣都是十個挑不到就認為沒有成功了...
※ 編輯: boblu           來自: 71.10.75.57          (08/07 13:42)
推 icome:你該不會兩個搞反了吧?
?

推 mattmatt:4ug 1uL RE切4小時有點不太夠..會有不完全切完的可能..
→ mattmatt:減少plasmid的量&增加切的時間再試試看吧...切ON試試?
推 tsubasawolfy:BamHI切ON要看廠牌XD EcoRI倒是沒差 最後ligation
→ tsubasawolfy:也用不到那麼多的DNA 減量應該行的通'
我沒有 O/N 是怕 star activity

而且同時切了 TA construct, 裡面的 insert 有 release 出來

當然 可能有 gel 看不出來的沒切完全的部分

而且我 gel extraction 的時候, double digest 的 vector 的 band shift 沒有很大

所以還是有 切膠的時候就沾到沒切的 vector 這種狀況的可能吧

下次試試 O/N 然後把膠跑開一點再切看吧
※ 編輯: boblu           來自: 71.10.75.57          (08/07 23:05)
推 afunafun:可以將ligation產物再用ClaI切30~60分鐘
→ afunafun:不過要先確認你的insert有無ClaI切點
→ afunafun:在pCS2上的BamHI及EcoRI兩切點中間剛好有ClaI site
→ afunafun:可以將沒切乾淨vector給切除 這樣可不用重做
可惜剛剛好就是有 ClaI site :(

但是應該可以直接合成 oligo 把 pCS2+ 裡面的 ClaI site 置換掉？

不過我沒有這樣做過

在哪些步驟需要額外的製換 buffer / 去鹽 / 濃縮嗎？

還是 ligation product 直接加 RE 與 buffer 反應時間夠了以後
就可以直接拿去 transform?
※ 編輯: boblu           來自: 71.10.75.57          (08/08 03:32)
→ boblu:大 E 之後推一下 請大家繼續指教
→ match308:如果做法都沒錯的話,建議你換個ligation kit吧,推薦roche
推 bluecsky:你挑出來失敗的產物是比較像是self-ligation的嗎?
→ bluecsky:如果挑了10個都沒拿到 那可以考慮重做一批試試看
→ bluecsky:我覺得可能是enzyme digest跟CIP都沒完全造成的
→ bluecsky:你或許可以嘗試一下 讓digest時間拉長 CIP時間1hr夠了
→ bluecsky:只怕CIP是失去了活性 不過理論上兩刀應該不cip也沒差
→ bluecsky:大多的時候 vector only是可能會長 不過量非常少就是了
其實長了不少

所以我猜不是 self ligate 就是一開始就有帶到沒切動的

重做一次的時候會加作 vector only, no ligase 的 control

這樣就算做不出來 也會比較知道哪裡出問題

→ bluecsky:對了 你有分別單獨用兩種enzyme去試者切你的vector嗎?
→ bluecsky:說不定有一刀根本沒有 但是你看不出來??
沒有試那個 vector

不過因為作的時候是跟 TA construct side by side 作的

TA construct 要兩刀才會 release 出我要的片段

這一部分確定是有 work 的（但是不知道效率）

應該也可以由此推測 enzyme 跟 buffer 都是好的

除非 vector 續列特別造成不好切？

重作的時候也一起試試看好了 感謝提醒 m<_ _>m
※ 編輯: boblu           來自: 71.10.75.57          (08/08 09:45)
推 bluecsky:有時候是vector根本就是錯的或是壞的 這也是遇過
淦 現在想想還真的有可能

因為那管 pCS2+ 不是我抽的

我也沒有拿去 sequence 過......

hmm 真的至少應該送去把 MCS 部分 sequence 一下...

（RFLP 未必看得出來 因為 pCS 系列好像很多 vector 切出來都會很類似？）
→ bluecsky:另外常見的錯誤有:1.plate抗生素壞了或是濃度錯了
→ bluecsky:所以你可以嘗試看看直接塗competent cell上去會不會長
這個錯誤事實上出現過 現在應該已經解決

→ bluecsky:或是2.操作的器具有汙染 不過這種colony會很明顯不是
這應該不至於

→ bluecsky:基本上這些都遇過 但是不保證真的有發生在你那邊..
謎 謎 謎 囧rz
※ 編輯: boblu           來自: 71.10.75.57          (08/08 14:07)
推 veltine:100%這個數字在生物學上行不太通，就好像一開始碰cloning
→ veltine:一直以為enzyme在它喜歡的buffer裡，就會有100% activity
→ veltine:其實不然，雖然做double digestion但是難保vector同時被
→ veltine:兩種enzyme切到；以你的問題為例，說不是你的vector只被切
→ veltine:一刀，vector只留一個cutting site，ligation時…insert
→ veltine:只有一邊被接上，造成你的vector only的plate長很多…
→ veltine:vector+insert的plate長很少，當然這只是推測…Orz
→ veltine:建議確認vector上的MCS沒有壞，用EcoRI及另距離一很遠的
→ veltine:enzyme切切看，sequencing也是可以確認但有時不怎對...Orz
推 bluecsky:找特異性序列或是重新從最初的stock拿來用..
推 tsubasawolfy:公用操作器具污染很好玩..送九千長一堆很高興
→ tsubasawolfy:抽出來全部都三千 WTFS
推 aceliang:樓上同感...還有人給我分裝competent cell用用過的tip
→ aceliang:什麼都不用加，長爽爽