[討論] 有關E.coli是否會踢掉plasmid的問題

[McRay (文昌帝君)]

  版上各位朋友

  小弟最近正在做cloning ，正好做到從LB/Amp plate中挑選colony 做 PCR

  確定是否有DNA insert。


  我的方式是用10 ul的 tip 點菌接種到 20ul 的 LB中，在37度中培養一小時後

  取1ul菌液做PCR，計畫再將確定有夾出片段的菌落取至LB/Amp中養大抽plasmid。



  菌在LB only中37度培養一小時後,放在四度冰箱一天

  後來我的同事告訴我這可能會導致E.coli將plasmid踢掉，因為環境失去了

  Amp選擇的壓力；後來我又補了50ug/ml的Amp使其在四度中放置兩天


  請問大家，這樣處理的菌如果真能在2ml LB/Amp中長起來(取1ul菌液在2ml LB/Amp養)，

  會不會抽不到plasmid?

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◆ From: 111.82.118.201
→ gryou:我不清楚這樣會不會踢掉 我都是抽小量 用enzyme來確認的
→ gryou:而我的作法是 養菌完後 馬上離心 除LB上清液後 丟-20度冰箱
→ gryou:目前是都抽的出來！！也沒踢掉的問題！
→ gryou:小量：6ml LB + 100 μg/ml Amp (會保留1ml作菌種)
→ skyken10:當E.coli繼續複製之後~子代的plasmid會快速的降低
→ skyken10:而原本的E.coli應該不會lose掉plasmid~!
→ match308:踢掉plasmid的細菌不就長不起來了嗎,長得起來就只剩有的
→ bill90128:良心建議:做實驗還是一口氣做完比較好。放來放去的實驗
→ bill90128:品質難以控制。萬一實驗失敗了，要追蹤也不好追。
推 yaliu:我的作法是，colony+10ul LB+Ap，直接colony PCR（取1ul）
→ yaliu:接著再加1ml的LB+Ap，養隔夜...隔天應該就知道哪個要哪個不
→ yaliu:要了吧
→ yaliu:所以我一開始就放在1.5ml epp.裡面～我覺得還蠻方便的
→ McRay:感謝各位! 星期一抽的結果會跟大家報告的
推 spirithorse:直接用滅菌牙籤點菌後,先沾到Amp plate,再沾到PCRtube
→ spirithorse:做colony PCR,然後就可以拿到PCR結果和有號碼的plate
→ spirithorse:Amp只是抑制菌的生長,不會殺死菌,所以放久會有雜菌