[求救] cloning

[iwenyo2 (柚子)]

最近利用commerial的TA cloning
將需要保存的gene 以profreading Taq PCR 後
切膠純化後  做A- tailing
以kit ligation transform 至DH5a
隔天長出colony 以colony PCR 後得到我想要的產物(~400bp)
但clony養liquid 抽plasmid run PCR 後卻發現
除了目標產物外  有一個很大的band (>3K)
想請問 那個band 雜band嗎?  為什麼colony PCR 跟plasmid DNA PCR 結果會有差異??
麻煩了
感謝!!!





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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 163.25.118.160
推 aceliang:很大的band是多大？RNA沒弄乾淨阿？
推 boblu:抽 plasmid 抽出雜 band 跟cloning 有無成功沒有直接關係吧
→ boblu:另外你忘了說你 plasmid DNA PCR 出來的結果為何？
→ iwenyo2:plasmid DNA PCR 結果除了目標產物外還有一個很大的band
※ 編輯: iwenyo2         來自: 163.25.118.160       (08/17 23:06)
→ blence:是你的plasmid;兩次PCR的template差異很大,當然不需比較
推 takumatw:怎麼會有proofreading的taq???是混和酵素嗎???
推 cloneting:可能是template太濃 稀釋更高倍試試吧
推 yaliu:同上~
推 mattmatt:同上 plasmid PCR只需1 ng以下的template..
→ mattmatt:高於100ng就很有機會在膠上看到plasmid本身 定個量吧~
推 icome:用RE check看看 PCR條件不對常常有怪事發生
推 blueashin:變成 iPCR??
→ rimeni:是你去做PCR的template~plasmid DNA做PCR 20ng足足夠了