[求救] DNA基因片段pcr無法擴增

[blueashin (tRoMboNe pLaYer)]

各位好

我想要求救的問題是:

我進行一段DNA片段的PCR擴增

已經試了一段時間了 完全沒有辦法擴增出來

但是我對該基因進行 RT-PCR 擴增是沒有問題的

以相同的primer進行DNA的擴增卻無法擴增

更奇怪的是

我把該DNA片段 拆成兩段作PCR卻可以做出來

例如 該片段總長度為2000 bp

由1-1500 可以做出來 由1400-2000可以做出來

可是做1-2000卻不行

真的很奇怪

不知道各位先進有沒有什麼看法

請大家指教

我的pcr條件:


94 C 5 min
94 C 1.5 min }
60 C 1 min   }
72 C 2.5 min }  40cycle
72 C 5 min

基本上以2k 的長度應該一定要可以才對

但是做不出來



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 111.242.135.19
→ blueashin:忘記說 我用的酵素是 C牌的 advantage 2
推 aeroufo:妳可以把1.5 mins 調成 2.0 mins
→ aeroufo:再者，妳跑那麼多cycle幹嘛??30就夠了啦
→ aeroufo:不信妳可以去測，妳跑高於30妳的PCR產物也不會高到哪去
→ blueashin:= ="因為怕放不出來...才會做這麼多cycle
→ aeroufo:因為酵素沒法這麼耐，除非妳跑到一半加酵素
→ blueashin:恩恩 謝謝你的意見 我會試試看~^^
→ singren:會不會兩各primer的Tm值差太多..
→ Ianthegood:既然分成兩段做得出來就分開跑好再混在一起吧XD(誤)
→ Ianthegood:混起來再跑一次全長?
→ blueashin:如果分開放 我想必須要先用限制酶切過 再做ligation
→ blueashin:才能再放全長 這個部分我做過 之前沒成功
→ blueashin:但理論上DNA一定要放得出來才對...
推 Fourfish:請教一下 你有沒有考慮到intron的問題？確定一下primer是
→ Fourfish:不是跨exons 另外94度降到30s就夠了 煮太久對酵素也不好