[求救] clone不出來

[JuneTiger (JuneTiger)]

2.8K這段我已經有成功接在pGEX上
但是要把他再接進去flag
卻一直接不出來 希望大家可以給我一點建議

我實驗的步驟在下面  希望大家可以幫我看看問題出在哪...

1) PCR

10X buffer         2.5
dNTPs              0.5
Primer-R           0.5
Primer-F           0.5
DNA polymerase(pfu)0.5
DMSO               1.5
ddH2O              18

->clean up->跑膠(跑起來是single band)



2) 切RE
                                                                                buffer 3         5 ul          buffer3      5ul
PCR product     15 ul          flag(midi)   1ul
NotI           1.5 ul          NotI       1.5ul
SalI-HF        1.5 ul          SalI-HF    1.5ul
100X BSA       0.5 ul          100x BSA   0.5ul
ddH2O         26.5 ul          ddH2O     40.5ul

作用37度，3小時 -> clean up ->跑電泳


3) ligation

vector         4 ul
DNA            8 ul
T4 ligase      1 ul
ATP            1 ul
buffer         2 ul
ddH2O          4 ul


4) Tansformation(DH5alpha):

on ice            30min
HEAT-SHOCK 42度   90sec
on ice            2min
LB培養            3hr
塗盤(LB agar Amp) O/N

(菌落都沒有長的很大，比較大的約只有0.1cm，大的很少，一盤大約只有10顆以內
 很多超小的菌落，不太像衛星，因為是很均勻分布在整個盤子上，應該有幾百顆 )

5)colony PCR

  很小的跟大顆的都有P，都沒有P到我要的東西，但是有P到很多條band

  P.s有拿空的flag做transform，但是長出來的也是很小的菌落，滿滿的一盤
     不知道是不是因為塗盤的時候下太多了?!

                                                                                希望大家可以幫我指點迷津

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◆ From: 114.47.66.228
→ Rarelay:你的 lagation 應該要寫 insert 跟 vector 的濃度
→ chaunen:flag的vector是lenti的嗎?
→ nerdz:我沒誤會的話你給的全是體積單位..有意義嗎
→ JuneTiger:沒有測inser跟vector的濃度耶@@ 跑完膠亮度大約是1:2
→ JuneTiger:flag不是lenti
推 FENOR:你的問題是不是要再那個2.8K的gene前或後端接上flag
→ FENOR:如果是的話，當初我也做過類似的東西，不過我用的是類似
→ FENOR:做shRNA的方法，先訂兩條primer，接著讓他們在高濃度下黏合
→ FENOR:最後黏合出來的產物跟已經切好的PCR product一樣，再將其
→ FENOR:接入。
推 aggaci:樓上的方法的primer要先磷酸化，或是黏好的產物要再磷酸化