[求救] RT-PCR的一些小細節

[cmublue (BLUE)]

最近在做RT-PCR想看sample間基因大概的表現量差異

我第一次PCR是做26cycles

老闆說cycle太高了會看不出差異  所以我又降為24cycles

之後拿去跑膠 我用小comb去跑   sample:dye  1:5    (合計6ul)

感覺似乎太多了 都會滿出loading site   (不知道這樣會不會影響到裡面DNA的量)


前面是一些雜言


我想問的是

該注意哪些小地方 才能清楚的看清sample間的差異


例如sample跟dye的比例該怎麼調整  and EtBr的作用時間長短該多少



(抱歉敘述能力不好 希望有大大看得懂我的問題 感謝)

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.128.67.246
→ gryou:為何不用qPCR來定量？
推 cbeta:跑qPCR就可以了啊～
推 captdavince:這種好像跑qPCR的data才能夠人家相信..話說回來.印象
→ captdavince:中純粹RT-PCR看差異..你可能要先抓還在log期的cycle
→ captdavince:畢竟一到plateau期..你看的東西就不準了
→ captdavince:sample跟dye的比例不是直接看你的dye是幾倍的就照倍數
→ captdavince:跟sample混就好?
→ chaunen:try 不同cycle數 18 20 22 24 之類的...
推 mattmatt:google: semi quantitative (RT)-pcr 或 半定量
→ Ianthegood:qPCR啦 RT不好做quantitative
推 yawai:如果dye是6x  應該是sample:dye = 5:1 吧
推 Ianthegood:dye不會影響EtBr後的亮度 只是讓它不要飄 多一點無妨
推 sunday30430:我跑30個CYCLE耶!