[求救] ligation 的問題

[DJHINN (dj)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

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我用的材料是  pGEM T easy vector (3K)

insert長度大約 2.4K

現在問題是，我加完所有ligation 的solution後

放在室溫約 6 hr後才放進 4度C冰箱.......

請問這樣還有救嗎?


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 111.240.131.123
→ saviora:試一下囉 ligase在4度活性會降低很多
推 spirithorse:ligation最好是16度,如果隔兩天才要transform的話,
→ spirithorse:我就放冰箱,隔天要transform就放室溫
→ spirithorse:我學到的好像是差在碰撞機率耶...
→ DJHINN:其實  各家的protocol都不太一樣  有16度 overnight和 4度
→ DJHINN:我是有得到一個答案，室溫可能已經working完了.....
→ DJHINN:在低溫的狀況，ligase的活性較低，因此可以慢慢的ligation
→ DJHINN:以得到最大效率!?  我的思考是這樣  =  ="
推 tsubasawolfy:pGEM Teasy這套不是rt一小時就可以長一堆嘛？
→ qumai:室溫也是可以反應的~ 繼續做吧
→ DJHINN:恩....但是最高效率還是4度C啊  XD  而且我的insert長了那
→ DJHINN:麼一點  有點心慌  XD
推 tsubasawolfy:這套有沒有4度 ON其實都一樣 最大差別在transform
→ tsubasawolfy:recover的時候SOC跟LB差很多
推 icome:室溫一小時就可以了
推 missal:做過室溫十分鐘...
→ DJHINN:我在 transform 用的是commercial的comptent cell
→ DJHINN:並沒有用到 SOC，而是直接transform在LB上，樓上的大大
→ DJHINN:是要我另外加上SOC嗎?
→ DJHINN:=  =  commercial的competent裡面應該就有SOC了吧  XD
推 tsubasawolfy:................
推 sunnyforever:樓上息怒XD t大指的是medium用SOC比用LB更好
→ sunnyforever:所以heatshock完放冰上以後加SOC再incubation
推 miaw:其實如果用heat shock~幾乎不用修復耶! ^^"
→ miaw:我都直就塗plate了~
→ DJHINN:所以  我才說  我用commercial的根本就沒有recovery的步驟
→ DJHINN:他heatshock後直接塗在  "預冷"的plate上 (算一種recovery?
※ 編輯: DJHINN          來自: 140.112.80.2         (11/19 15:10)
→ DJHINN:所以  另外用SOC  處理會比較好就對了  =  =?
推 miaw:個人經驗,當年電菌後修復,用LB跟SOC長的colony量差不多~
→ DJHINN:我只是 heat shock啊  XD
→ saviora:低溫下annealing會比較好 ligation效率變差
→ saviora:低溫下annealing會比較好 ligation效率變差
→ saviora:溫度較高下則相反
推 tsubasawolfy:我說的soc跟LB是用他附的的comptent cell
推 tsubasawolfy:而且他也有寫9. Incubate for 1.5 hours at 37°C
→ DJHINN:我用的  是  yeasten的 competent cell....
→ DJHINN:不好意思....我發現...我LA打成LB  了  ...對不起  =  =+
推 sunnyforever:搞了半天是yeastXDD
推 sunnyforever:          yeasten
推 sunnyforever:這樣應該依照各家廠商的protocol為基準會比較恰當吧