[求救] 請問ligation

[ennnnno (小玲)]

大家好...
剛剛爬了文...參考了很多人ligation的作法
不過我有一點疑問


我是用PGEM_T vector (promega) 3k

insert DNA 2K,比例vector:insert=1:4

經藍白篩之後, clone的數量也是很少><

ligation是 16度 overnight

想請問大家以下的問題:
1.pcr產物一定要先經過純化嗎?

  問這個主要是因為我記得碩士clone時好像沒將pcr產物純化

  直接和pgem t vector做ligation

  不過在現在的實驗室要,想請問有無純化真的有差別嗎?

  因為我gel extraction的濃度會變的很低

  一開始pcr會p大概五管左右,再全部濃縮成50μl

  跑膠完其實band還蠻清楚的,但是gel elute完後再取約2μl跑膠

  band很弱,做了兩次都一樣,實在不知道問題是什麼

  是用QIA的KIT去純化的

  所以想問問看是否一定要先經過純化?

2.gel extraction為何濃度會那麼低呢?

  都是造protocol去操作的, 到底問題是....?


先謝謝大家了,遲遲clone不出來好沮喪啊>"<







--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 220.136.22.186
→ Ianthegood:最後beads overdry跟pH不對是最常見的吧
→ tsubasawolfy:1.PCR純化可以去除PCR過程中產生的non-specfic band
→ tsubasawolfy:2. 看人品看kit穩定度看band的粗細看切下來膠的大小
→ tsubasawolfy:看做膠的品質跟融點  通常有回收一半就不錯了
→ blence:正常使用gel extraction kit效果不只一半,product不要太大
→ blence:太小的話,都可以有8成,最大的問題是做cloning的貪心,很多人
→ blence:用過少的elution buffer想要得到高濃度,殊不知是反效果
推 iceking:當然要純化,不純化做得出來我只能說是運氣
→ iceking:2ul跑膠band當然暗,你一定是體積加太少,不敢多取來跑膠
→ iceking:還有切下的膠一定要小純化的效果才比較好
→ iceking:還有enzyme作用完,ligation前也一定要純化,我是用酒精沉澱
推 yaliu:如果是single band的話，可以用clean up，回收率比切膠多
→ yaliu:不然只能用切的了，sample可以集多一點去elute，切膠純化就
→ yaliu:不會覺得不夠了～基本上我都是PCR產物用100ul去elution
→ yaliu:最後用20-30ul "水"回溶，建議不要用TE buffer或kit的buffer
→ yaliu:溶，會干擾反應
推 iceking:Kit的buffer其實也就是Tris而已,不含EDTA不會影響後面實驗
推 fcku413:除非你P的很多雜BAND 不然通常不需要gel extraction吧@@
推 qumai:推樓上 沒雜BAND的話 直接用pcr cleaning kit 回收率高很多