作者monicatsen (monicatsen)
看板Biotech
標題[求救] ligation+primer desing
時間Thu Dec 9 23:45:54 2010
最近在做長片段的ligation
insert片段為2.3k
vector 6.4k
但一直接不起來 塗盤都沒長clone
insert及vector酵素切overnight
接著做純化
ligation 現在用的條件是照ligase的protocol
I:V=3:1
22度 overnight
勝任細胞也是用買的(其他人用ok)
基本上我所有使用的酵素、buffer其他人都有用
所以不覺得藥品的問題
目前的策略是
先將PCR product送定序確認是否為目標基因
及再重新抽新的vector再重新切過
想問一下大家有沒有其他的建議
另外想請教大家:
我爬了前面的文章 有提到關於RE site
我在primer設計的時候
沒有在酵素切位前多留nt
------XXXXX
(-是酵素辨認的序列，X是我的目標基因，-前面我沒多留nt)
這對接長片段insert會有影響嗎?(怕RE沒辦法認?)
又如果我要重設primer應該要補多少個nt
而這些nt是不是有建議要ATCG哪一個比較好?
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◆ From: 122.116.97.104
※ 編輯: monicatsen 來自: 122.116.97.104 (12/09 23:49)
推 williamyang:要不要先做TA cloning把PCR產物接進去再往下做做看 12/10 00:11
推 hangzer:你如果是用NEB的限制酶 可以去查一下 我記得都要多留幾個 12/10 00:41
→ hangzer:base限制酶才能有效的作用 還有我也贊同樓上提的 先做TA 12/10 00:41
→ hangzer:再去接會比較方便 12/10 00:42
→ hangzer:酶的效率 有些需要多留base 才有辦法切的動 12/10 01:03
→ blence:不是看oligonucleotides,要看linearized vector的表才是 12/10 01:32
→ fcku413:推H大的那個 當初PCR也是根據那個 要注意切的時間 12/10 02:05
推 yaliu:不留mer是切不起來的~若真不想留mer，只能作TA cloning了 12/10 08
:28
※ 編輯: monicatsen 來自: 120.126.52.76 (12/10 18:00)
※ 編輯: monicatsen 來自: 122.116.97.104 (12/10 22:28)