Re: [求救] 長片段ligation+primer desing

[monicatsen (monicatsen)]

剛剛定序結果回來 我的PCR product是我要的target gene沒錯
然後 使用的RE是fastdigest(Fermentas)的產品
目前的策略是打算先做TA

所以 想問一下 我下列的想法對嗎?
因為實驗室的DNA polymerase都是有proofreading功能的enzyme
所以 我想另外買Taq DNA polymerase
然後先用有proofreading功能的酵素跑PCR-->切膠純化
再將純化的PCR產物用Taq做A-tailing 再接到 pGEM-T vector

也麻煩大家推薦一下便宜好用的Taq我只要用來做A-tailing即可~
謝謝

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◆ From: 122.116.97.104
推 luke12182006:跑完PCR直接做ligation應該也可以吧...
→ monicatsen:前篇有寫道因為是接2.3k 接不起來 聽大家的建議才用TA
→ untilnow:如果有其他種的勝任細胞，建議試一下，有時候某一種的勝
→ untilnow:任細胞就是和某些plasmid不合...
推 yaliu:有在賣pfu+Taq混合的polymerase，是叫superTaq嗎？？ 忘了
→ yaliu:直接加A理論可以，但我沒真正嘗試過就是了，自己心裡會覺得
→ yaliu:怕怕的，就這樣加在一起就會有A了，自己是覺得蠻不確定的XD
推 qumai:可以先純化pcr產物 然後加taq跟dATP反應一陣子就會有A了
推 Ianthegood:platinum taq是proofreading+A tail阿 先把家裡的
→ Ianthegood:enzyme搞清楚吧 不行的話A tailing也不難做
→ Ianthegood:室溫過量taq過量A 30min就OK
→ monicatsen:我們家的是pfu 所以確定是部會有A tail 確定我要再另外
→ monicatsen:做A tailing 總之大家說的我都會再試試 謝