Re: [求救] 一些關於blocking的問題

[boblu (六百)]

※ 引述《owl628 (owl628)》之銘言：
: 因為最近開始接觸western跟ICC
: 大部份都是到處問人以及上網找資料做的
: 因此有些關於blocking的部分有點疑問
: blocking中使用的脫脂牛奶裡面的蛋白質會均勻的附著在你的membrane上
: 藉此避免後續的抗體反應造成一些非專一性的結合
: 想請問這裡所說的後續抗體,是指一抗或二抗,或是都是
都是 但主要是一抗

: 此外有看到說假如進行有關磷酸化蛋白的WB
: 就只能用BSA進行blocking,是因為牛奶中含有磷酸化的蛋白質嗎???
不熟。略。不過我聽過類似的說法

: 最後就是進行ICC時他的blocking buffer要針對二抗來選擇
: 假如二抗是goat anti-mouse,就要用normal goat serum,有點不懂原理為何???
二抗裡面可能有一些非專一的抗體，

且這些非專一的抗體也已經被 tag 上酵素或其他的東西

所以當他們黏到你的樣本上以後 就會被偵測到

加入跟二抗同樣來源的 normal serum

幾乎可以這裡面說一定（<--收物學上說這兩個字很危險，不過你知道我的意思...）
也有跟你的二抗一樣的非專一抗體

但是 normal serum 裡面的當然沒有 tag

因此就會跟二抗中的非專一性抗體競爭，產生佔著茅坑不拉屎的效果

: 不能用牛奶,BSA之類的嗎???
可以 跟二抗同源的血清是最安全的選擇但也是最貴的

其他 blocking agent 可不可以只有試了才知道

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◆ From: 97.92.0.42
→ saviora:牛奶裡面會有磷酸化的casein
→ blence:其實我染過sigma的BSA也有phosphorylation,另外目前針對磷
→ blence:酸化蛋白的抗體也用milk也做的好好的
→ zeratul1396:我家的BSA也有 現在很困擾 老是髒髒的
→ zeratul1396:有大大有推薦的BSA廠牌嗎??
推 chrissim:我做磷酸化用牛奶也好好的..BSA廠牌應該很多人用SIGMA吧
推 leoblack:BSA做起來通常會比milk髒沒錯,畢竟milk中蛋白質比較多元
→ leoblack:blocking效果會比BSA好,但磷酸化實驗,用milk做得出來,那
→ leoblack:是你運氣好,買到不錯的抗體,但請不要當成常態來看待