[求救] Cloning

[alicialai (Fairy Monster)]

Hello, 大家早, 最近face到很annoy的問題,
我想了半天都想不出辦法來, 請大家幫忙解惑..

實驗步驟大致上是這樣,

因為我的final construct have to be in pDM4 vector (7kb)
但是因為這傢伙很胖+copy number低,
所以我選擇先在pBluescript上做construct.
我的final produc in pBluescript 是3kb (2個片段+一個antibiotic marker(Tet))
很不幸的, pBluescript也是3kb, 造成我無法用enzyme分開,
(other enzyme in pBS lab沒有, 新訂enzyme是最後的辦法)

所以我的處理是用respected enzyme切後直接purified做ligation,
之後用double antibiotics marker selection.
Tet(另外接進去的) and Cm which is the marker for pDM4,
這樣便可以殺掉self-ligation (指insert接回去pBS).

然後問題就來了!

Transform後隔天有colony, colony PCR (pDM4 primer) is positive.
但我inoculate to liquid LB之後他就不長了,
但同樣的colony我restreak on new plate(2 antibiotics)就長得很開心,
試了兩次都這樣... very annoyed!!!!!
想請問大家有沒有碰過類似的問題以及有沒有建議的方法呢?

感謝大家憂^__________________________^







--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 130.194.92.116
→ Invec:只有我看不懂原po在寫什麼嗎...?
→ milkpa:我suggest你在養liduid的時候decrease抗生素to 1/2 or1/3量
→ Invec:針對cloning,完成pBluescript的建構後,用M13 F+R和 pfu酵素
→ Invec:作一次PCR再用限制酵素切就能得到你要的組合片段了
→ Invec:pfu, M13 F+R primers 應該連隔壁實驗室都借得到...
→ soom:找看看有沒有pBluescript上有而insert沒有的RE切位
推 conective:中英文參雜個人認為不好閱讀 真正的專有名詞寫英文就夠
→ alicialai:謝謝大家...
→ alicialai:抱歉中英文參雜, 我想打中文, 可是我的中文快忘光了..
→ alicialai:起先我想打英文, 可是我想應該更少人會看吧
→ alicialai:抱歉造成閱讀困難.. 我下次用google翻譯好了
→ alicialai:and, 我只是希望能解決問題, 並沒有其他的意思
→ turtle24:google翻譯會比現在更難閱讀唷 XD
推 yaliu:想建議你medium and plate去確認一下是否OK~
→ yaliu:liquid是完全不長還是長得不好？
→ yaliu:plate可以liquid不行，挺矛盾的....
推 huhu126:1.換E.coli strain, 2. 使用rich medium 再試試
推 mattmatt:colony長在plate上和菌懸浮在LB裡面 抗生素實際作用濃度
→ mattmatt:會有落差 液態裡面菌體分散 抗生素很容易抑制"每一個"菌
→ mattmatt:菌體來不及生產兩種抗抗生素就會被殺死
→ mattmatt:建議你plate上先用兩種抗生素篩選 挑出single colony後
→ mattmatt:液態用你接進去的抗生素(Tet)一種就好
→ mattmatt:液態用兩種的話濃度都減半 不然菌會長得很慢 甚至不長
推 bider:你有沒有辦法找到pbluescript有的但是target seq沒的RE site
→ bider:多切一種酵素 讓片段可以分開
推 Realthugz:真好奇你是哪國人