Re: [求救] Ligation 一直無法成功

[dodomilk (豆豆奶)]

我ligation做了三個禮拜，參考過很多protocol都失敗，最後是自己亂做做出來的


作法如下：

vector: double digest → clean up → CIP → clean up  ┐
                                                      ├→ ligation
insert: double digest → clean up ──────────┘


特徵：不用做gel extraction

重點：1. restriction enzyme 一定要切乾淨，我是用五倍建議量反應兩倍時間

         也就是10倍劑量。不用擔心會亂切，我做到現在還沒發生過這種事

         (建議量：反應體積50ul、37度C下1小時，每unit可切1ug的DNA)

      2. CIP也要做乾淨，我是用一倍建議量反應兩倍時間

      3. vector在double digest和CIP之間的clean也許可以省略

         當時會clean是怕restriction enzyme黏在那邊CIP無法作用

         但後來聽實驗室其它人都是切完直接加CIP...

      4. insert在PCR時template放越少越好，最好<100pg，以免干擾之後的transform

         如果不放心的話，可以在PCR結束後加DpnI把template切掉


因為每次我gel extraction完，elute出來的DNA quality都很差，吸光區線一堆鋸齒很醜

我想可能是我做gel extraction的時候，哪個步驟出了問題

後來自己想到也許可以這樣做，莫名其妙就做出來了


ligation product可以拿一些(5~10 ul左右)出來跑膠看有沒有連接成功

如果看得到vector+insert的linear form的band，表示至少有一端連接成功

另一端也成功的機會很大


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 124.218.20.234
→ Realthugz:反應時間長會不會亂切看enzyme吧 不是看運氣的
→ Realthugz:然後... ligation不就把linear接起來嗎??
→ Realthugz:跟送進e.coli甚麼關係... 不然buffer裡dNTP幹嘛的?
推 Realthugz:記錯 ATP
推 akongapple:請問你的clean up步驟是指做甚麼樣的處理？
→ akongapple:另外，我記得有作CIP的話，一樣會形成環型，只是因為只
→ akongapple:將insert的5' phosphate group接到vector的3' -OH，但
→ akongapple:是vector上沒有5'phosphate group，所以會留有一個nick
→ akongapple:送進E. coli後才會把這個nick補起來。
→ dodomilk:嗯 那是我觀念錯誤，我修一下文
→ dodomilk:反正這樣做得出來就對了
→ dodomilk:clean up是跑這個kit http://tinyurl.com/3n39o57
→ dodomilk:一般的gel extraction/PCR clean up kit應該都可以
→ dodomilk:一樓，我就是用號稱很容易亂切的EcoRI和BamHI
※ 編輯: dodomilk        來自: 140.109.40.39        (04/28 10:27)
推 icome:其實RE跟CIP可以加在一起反應 不過我都是後加CIP不換buffer
推 chung1987:同樓上，RE跟CIP一起加，較省時間
推 ooufo:問一下~100ng的template會長幾顆?
→ dodomilk:至少要10萬顆
推 VincentYan: 很好奇你老闆看到如此揮霍的restriction enzyme劑量會
推 VincentYan: 有何反應? 很貴欸