Re: [求救] 請問冷凍切片螢光染色的小黃點..

[mikis1107 (mikis1107)]

※ 引述《twcitizen (Sterco-Cephaly)》之銘言：
: ※ 引述《mikis1107 (mikis1107)》之銘言：
: : 我想請問冷凍切片的免疫螢光染色結果
: : sample組上面出現的小黃點是甚麼東西
: : 有方法可以避免嗎?
:   我有做過組織免疫染色以及相關hybrdization實驗
:   不過之事很久沒有更新，請指教
:   第一點
:   back-round noise (white noise)
:   對於white noise，增加signal是個不錯的方法
:   但是減少noise也很重要
:   S/N比會上升
: : 去OCT
: : lysotracker 50 nM, 37度, 40 min
:   既然是免疫染色，使用lysotracker(?是一種probe?)要做什麼？
喔喔這是lysosme的maker

: : PBS wash
: : 4% paraformaldehyde固定 RT 10 min
:   既然是冷凍切片，為何還要用固定過程？
:   多一項過程就會多很多項變數
因為我看on line protocol也都是有fix的步驟
可能是因為要固定內部蛋白表現
: : wash
: : 1% BSA RT 50 min
: : wash
:   BSA或許不錯，有試過其他的blocking agent?
目前正在試二級抗體的serum
一般用5%
要試的條件5%跟10% goat-serum

根據abcm onlne protocol
有說用paraformaldelyte固定的section
可能會產生許多free aldehyde group
造成高度的background
可以在blocking buffer中加入0.3M 的 glycine與之結合
降低背景值

或是換成aceton來block
這我試過但是染出來的效果會有螢光不均勻的現象

目前兩者也在試驗階段

: : 一級抗體 in 1% BSA 4度 O/N
: : wash
: : 二級抗體(488) in 1% BSA 37度 15 min
: : wash
: : Hochest 1:4000 RT 15 min
: : wash, mounting
: : 有詢問過學姊
: : 因為rat heat是自己取的有洗的比較乾淨
: : 而sample是請別人取的
: : 說可能是紅血球沒有清洗乾淨的關係@@
:   這要看你的一級與二級AB針對的是什麼
:   AB絕對不可能100％只針對target tissue抓上去
:   你去問學姐不如問教授，或者拿AB的data sheet來研究
:   上網去查這些AB有哪些人用過？他們的M＆M？
:   他們的結果與可能的noise在哪裡？
:   去問別人之前，自己做點功課會比較好
: : 學姊有建議我可以用biotin放大目標蛋白的訊號
: : 就是一級抗體+二級抗體接biotin+三級抗體接biotin
: : (應該是這樣吧@@)
:   假設 S = 5, N = 3
:   你使用增強的S = 7，但是別忘了noise是出自哪裡？
:   如果跟你的M＆M直接相關（例如1st, 2nd Ab)
:   那麼你的N也會增強，就比如N = 4
:   前S/N = 5/3 = 1.67
:   後S/N = 7/4 = 1.75
:   是有比較好，但是沒有好多少，noise的問題你不知道，就還是在那裡
:   只是就以前的經驗分享，當然請各位高手指正

感謝您的分享
就我目前手邊在try的條件會先試過在上來問人
感恩^_____^

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◆ From: 223.143.78.37
→ jihher:請問用goat serum & 用normal goat serum 作blocking會差
→ jihher:很多嗎? 我看它的價格差好多
推 twcitizen:脫脂牛奶粉很好用，我真的沒說謊 =///=
→ mikis1107:回J大:我不知道有這兩種的分別耶@@
→ mikis1107:回T大:所以免疫螢光染色的block也可以用脫脂奶粉囉??
推 twcitizen:http://0rz.tw/3Lyxq 學校有的話就去看，不然就館際合作
→ ddlittleq:T大 我看完你的文章了 可是通篇未提IHC阿 @@"
→ ddlittleq:小的經歷尚淺 若有不是 還請不吝賜教