[求救] western的running和壓片

[TCSSH ()]

http://img705.imageshack.us/g/dsc00711ta.jpg/

1.loading的問題 近一個月做的實驗在running時都會有殘餘東西在每個well上

  黑黑灰灰的 本來以為是sample煮完後太熱*(sample煮30min)  所以我接下來煮完後

  會將sample 放在冰上十分鐘 結果還是一樣 也有曾經懷疑是dye的問題

  但是過濾後情況依舊 在想會不會是loading太多sample*(我loading 200ug)

  這個還沒試不知道 但是一直試時間一過就是一個月 心理有點急了

  實在不知道這樣的問題在哪邊 不知道有沒有先進遇過同樣的問題

  (再試下去我看我就來不及口試了...)

2.壓片的問題 就如同圖中那張海苔一樣 我搞不懂為啥會這樣 囧

  本來以為是一抗的問題重泡結果居然一樣 二抗也重泡過 結果都一樣 囧

  搞不懂是因為我已經有N了 且實驗過程都一樣 除了最近在running出現的疑似遺留物

  怕提供的資料太少 我稍微說一下我的流程好了

  處理完sample, 定量(200ug), 煮30min,放冰上十分鐘, loading, run 30min 90v

  then 1hr 120v 讓55跑到底(我看pAMPK 63kda),transfer 70 min 90V

  (35min換一次冰),blocking(5% milk) 30min, wash 3x10 min in TTBS,

  一抗 pAMPK 1:1000 in 5% milk 溶劑是用TTBS over night 4度C, wash 3x10 min,

  二抗 室溫 2hr, wash 3x10 min, 壓片... 感謝讀完的人 現在頭在燒的人留



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 203.64.80.190
推 FENOR:第一次看到海苔狀...
→ FENOR:你要不要先去檢查壓片夾裡面有沒有怪怪的東西卡住
推 liuse:200ug.....
推 Marriott:200ug應該不是問題,我loading過20mg/well也沒事
→ TCSSH:應該不會有 因為我們是自己用顯影 定影濟洗的(人工)
→ TCSSH:昨天還被老闆念 一直不量解之前有做出來 現在卻一個月沒DATA
→ FENOR:這個實驗是你第一次做嗎? 我指的是你第一次用這支抗體嗎?
→ FENOR:另外我說的壓片夾，指的是你再放底片進去和membrane成色時
→ FENOR:用的那一個。
→ TCSSH:不是耶 這隻抗體是之前使用的 XD
→ TCSSH:至於壓片夾 我確定沒異物 XD
→ FENOR:那我真的不知道怎麼辦了@@
→ spirithorse:以前有做出來,是你做的嗎??要仔細想一下跟現在哪個
→ spirithorse:步驟變了!
→ jsi:或許可重新配置dye以及buffer 海苔是指一整片黑嗎?可能是抗體
→ jsi:太濃
→ FENOR:你看看要不要不要loading那麼多，先來個20ug試試看
→ kcc0606:loading 200ug,1抗又overnight 訊號一定爆強,可考慮ECL稀
→ kcc0606:釋個10~20倍去壓片.做IP時我才會用到200ug/lane
→ kcc0606:你的SAMPLE會有沉澱物嗎?如果是 就是sample buffer里的
→ kcc0606:SDS成份含量高,DENATURE後可考慮不要放冰上.另外好奇
→ kcc0606:denature為何要30min?煮那麼長 sample buffer顏色不會變嗎
→ TCSSH:謝謝各位先進的建議 我會在試試！！
→ sinighter:2抗dilute比例多少阿 一般我會先嘗試比1抗稀兩倍比例
→ sinighter:感覺是2抗太強或是ECL用太強的