※ 引述《TAKAHIRO25 (TAKA)》之銘言：
: 最近跑western blot 出現了一些問題
: 壓出來的band 背景都會有拖尾或 band忽大忽小的現象
band 忽大忽小? 考慮定量上是不是有誤差 , 一開始跑不建議超過100V
過了上層膠再開到100V
: 我列出我實驗的步驟
: 想請學長姐們可否幫我看看有哪些需要改進的地方
: 我收細胞目前是用trypsin收的 還沒用過lysis buffer 收過
建議用刮的 (加lysis buffer破細胞) 效果還不錯
: 收下來的pellet 則是看pellet大小 加入等量的 2X sample buffer 和PBS
: 接著再煮10min 兩次至三次 將pellet煮散
: (但目前問題是有時pellet過大都會很難全部煮散掉，不知道是不是
因為這樣才導致band有拖尾的現象? 其中也試著vortex很多次試著讓pellet完全溶解，
而且有時要煮很多次，不知道對protein有沒有影響? 不知有沒有較容易煮散pellet的方法)
收下來 pellet 太多可多加一點 buffer 進去沒錯 , 但為什麼不一開始就把細胞數目
控制好? 還是找到一個適合的數目再去做會比較好 (比如說 10cm dish 八分滿)
煮 protein 正常來說 , 95度 C , 5~10 分鐘就夠了! 不用再煮第二次
製膠方面 下膠凝固後需要等30min~到1小時再製上膠嗎?
: 因為在網路上查 很多實驗室好像都是這樣做的
: 我是製完下膠只要凝固後就馬上製上膠了
: 等膠製完會放到4度c冰箱放隔夜 再跑膠
: 隔天膠從冰箱拿出來後需要等冷卻嗎?
下膠至少等20分鐘以上 , 冰過後不需要冷卻也可以跑
: 我目前是拿出來等5min就 加入sample了
: 跑膠和transfer這裡就先省略
: transfer完後
: Membrane需要 wash嗎? 我這裡是以1/4 TBST稍微洗一下
不需要 wash ,可用 Ponceau 染染看轉過去 band 的轉弱
: 接著再blocking 兩小時 (blocking buffer 是用1X TBS + 脫脂奶粉)
TBS 記得加 tween20
: blocking結束後 以1X TBST wash 5min
: 再加入1抗 4度C overnight
: 隔天吸掉1抗 以1X TBST wash 5min 3次
: 再加入2抗 室溫 1小時
: 以上是我的實驗步驟
: 還請各位學長姐們幫我看看有哪裡需要改進的地方
: 謝謝
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