[求救] PCR 跑膠internal control一直不equal

[starjim (Jim)]

PCR完跑膠

但是卡在internal control一直不equal

導致一直無法繼續往下做

我用的internal control是beta-actin

已經重新跑過幾次PCR了

甚至連RT都重做了

可是就是一直卡在某個lane比較weak

每次跑完就是那個lane比weak

甚至我還把PCR完的product拿去用nanodrop測DNA濃度

結果是每管的濃度都差不多

我已經想不到有什麼方法可以解決這問題了

請問板上的高手有什麼其他的方法嗎?

謝謝~~







--
※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 203.71.94.31
推 flyeagle1978:PCR跑完去測濃度 沒有意義 因為buffer有鹽類 會干擾
→ flyeagle1978:你換GAPDH試試吧
→ starjim:因為我只是想確定product濃度是不是一樣
→ starjim:那測cDNA的濃度會有意義嗎?因為我也有測= =
→ boblu:每一管都有鹽類 背景值應該相同吧？
→ boblu:不然 blank 可以用一管沒跑 PCR 的 mix 去做
→ Realthugz:恩... 照樣可以normalize吧 可能你那特定sample的
→ Realthugz:RNA quality比較差一點
→ Realthugz:只要cycle數抓住 還是可以normalize吧
→ Realthugz:不然就是那組的treatment造成細胞數差異
→ Realthugz:根據你的敘述跟我的經驗 我也只能這樣troubleshooting
→ harry:cDNA或PCR產物若未純話去測濃度差不多，只能表示你的dNTP
→ harry:加的很準，你可以直接拿一點dNTP去測就知道了
→ jsi:可能beta-actin不是這實驗適合的internal control,建議可多找
→ jsi:找幾種常用的internal control gene做做看
→ mzac1b:那就把其他lane 都弄到一樣weak
→ mzac1b:不然就換GAPDH吧
→ starjim:目前又做一次已經算equal了~另外我也跑了GAPDH
→ starjim:只是還沒跑膠而已~謝謝各位的幫忙~~
→ Danielle:差很多嗎? 沒有差很多的話可以用image J做normalize
→ Danielle:如果差到肉眼可見兩倍以上就有點多了
→ starjim:我是用image J定量耶
→ starjim:可是肉眼看起來差不多~但是訂了就差大約0.9倍左右
→ starjim:訂了之後跑完肉眼看起來差不多