[求救] 蛋白質定量

[alicialai (Fairy Monster)]

大家好, 有一些蛋白質定量為跑western的問題想請教大家的意見,

主要是要看細菌感染細胞株(RAW)之後細胞內特定蛋白的表現量,
對未感染的細胞是用RIPA buffer再用BCA assay定量,
程序就很一般般的處理方式加入RIPA, ice, 離心後取supernatant定量,

但對感染的細胞而言我就碰到了些問題,
因為此菌為PC2-PC3 level, 會經由呼吸道傳染並為潛在性生化武器,
只要是有活菌都必須得在hood中操作, 除非經過高溫殺死所有的活菌, 然後問題來了,
RIPA打破細胞膜, 但菌還是活著, 我總不能把整台ELISA reader搬進hood吧,
有試過直接用sample buffer, 然後直接在hood中高溫加熱,
但此法造成我的loading control不是說非常的even,
想問說, sample buffer還可以測BCA assay嗎?

所以想請問大家是否有好的提議, 只要高溫加熱後就可以將細胞移出hood,
目前有想到幾個方案, 但不知道行得通否,

1. RIPA作用刮下細胞, 高溫, (移出hood), 冰上15min, 離心, 定量
  (此法tricky點在於我不太確定RIPA buffer是否可以加熱)

2. 用water作用將細胞刮下, 高溫, (移出hood), 加入等量2X RIPA buffer,
   冰上15min, 離心, 定量

3. sample buffer作用刮下細胞, 高溫, (移出hood), SDS-PAGE
  (這是最快速也簡單的方式, 但這樣我就無法定量了, 對嗎?)

這三種方法是我目前想到的, 不知道大家是否有其他的建議呢?

很感謝大家撥空看我落落長的文章..





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推 captdavince:刮下. supernatant 過filter?但是要考慮到膜的binding
推 captdavince:要不然你可以考慮買台Qubit..小台到不行..
→ alicialai:可是我要看的是細胞內的蛋白, supernatant沒有@@
推 captdavince:lyse掉.整個lysate過filter能把你的病原菌乾淨的拿掉?
推 wdman:取一小部分用方法一定量，知道濃度後，再取所需量加sample
→ wdman:buffer 去煮，再run gel
→ alicialai:所以RIPA buffer是可以加熱的嗎????