[問題] real-time pcr

[shienn (西恩)]

新手上路看了一下原理想問
real-time PCR只要看melting curve就可知道P出來的產物有沒有單一
為什麼不用再跑膠確認長度呢?
難道不會有單一melting curve 但卻P出不是預期的產物嗎???
(如primer夾出來的單一產物 長度(序列)不是我們要的)

還有real-time PCR的好處
是不是就只在於可以隨時監測PCR產物量的多寡
還是還有其他的好處@@?

像一般PCR
直接訂個30 cycle之類 丟在那邊就跑去做其他事
得到的結果不是一樣嗎?
反正PCR不是只是要放大片段 確認此序列的存在???



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
推 aggaci:誰說不用跑的? 有人甚至還拿去定序哩  不用每次跑是真的
呃... 學長說real time都是用量化數據來判斷@@
像是melting curve 所以不跑電泳
但不解的是不跑電泳怎麼知道擴出來的長度符合期望呢?
(結果他也不知道 就說反正看melting curve有單一產物就好)
像一般的PCR不都是跑出來長度以後 再拿去定序


推 Realthugz:不一樣吧 有不是每個sample丟30 cycle就解決了
對 我的意思是 目的是要放大片段
有必要隨時監控產量嗎?

→ soom:如果產物很多，在30 cycle前就飽和，你要怎麼判斷誰多誰少？
→ soom:如果是要做定量的話，real-time PCR就非常重要了
→ soom:但如果只是要看有/沒有表現的話，那一般PCR就夠了
原來如此 就是說有些實驗定量很重要...感謝解答~

推 tigernaxo:我以前跑完realtime都會跑膠看看...
所以realtime也是跟普通PCR一樣 無法確認產物內容@@?
→ Ianthegood:realtime不是拿來看有沒有的
→ Ianthegood:primer跟program都會先設計過 目的就是在定量
嗯 所以就是注重在過程
但最後不用確認序列(定序)嗎@.@?
就好像我們用普通的PCR 有時候雖然跑出預期長度
但最後送去定序結果沒夾到預期的序列
※ 編輯: shienn          來自: 140.112.52.225       (08/11 16:34)
推 Realthugz:主要就是soom版友說的那樣 爆表的話大家看起來沒差異
→ Ianthegood:就說realtime的primer都要設計成很專一 不會夾到別的
→ Ianthegood:東西 不會有其他band這樣
推 lucidol:melting curve可以看出專一性,但一般比較仔細的實驗跑完
→ lucidol:real-time之 後會跑膠與之對照,就可以排除你的問題所在
→ kemmy:你應該先去了解為什麼要做 real time PCR
→ kemmy:還有什麼是 real time PCR
→ kemmy:看你的問題就知道你對基本的原理不清楚