[求救] PCR產物的smear

[shienn (西恩)]

最近要篩選帶有點突變的一段序列

其中positive control一直跑不出來(就是用primer夾無點突變的wild type)

用gradient跑出來也全部smear

但我很確定我抽的wild type DNA沒有被degraded

因為篩其他的片段都沒問題

偏偏就這個跑不出來

至於我的PCR是
primer1(10uM)     0.5ul
primer2(10uM)     0.5ul
dNTP(2.5mM)         1ul
10x buffer        2.5ul
Taq               0.5ul
ddH2O              19ul
template            1ul
              ---------
total              25ul

之前想說會不會是template濃度太高 所以有減半過但還是smear很嚴重

請問除了annealing溫度 template濃度之外還有甚麼因素呢@@?


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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.112.230.173
推 oxoox:DNA濃度高的時候減半還是太多 請十倍稀釋
推 mattmatt:你要不要先把reagent.DNA.primer等濃度列出再來討論?
補了
→ Ianthegood:一般用gDNA跑的都是先稀釋過好幾個0耶 條件列出來吧
但用其他primer夾其他的片段都沒問題~"~
而這個primer設計上應該也沒問題
因為之前學長也跑出來過
就是不知道問題出在哪...
感謝回答~~~

推 yuyao:primer conc.應該是uM吧?是筆誤還是真的用mM.
抱歉筆誤 冏

推 sunnyforever:buffer裡面就含有Mg2+了嗎? 金屬離子也可能影響到
buffer是否有Mg2+ 這我就不清楚... 那我去實驗室的時候注意看看
※ 編輯: shienn          來自: 140.112.4.200        (09/24 11:15)
推 yuyao:有沒有可能primer壞了，重新拿stock稀釋或從訂。
→ sancra:所以template濃度到底是多少??
→ Ianthegood:對阿template濃度到底是多少
→ Ianthegood:還有program跟expected size也列一下
推 Realthugz:反應時間?