[求救] site-directed mutagenesis

[nhxcyge (人生就像個不可逆反應)]

我現在是做A基因的點突變，

用的方法是利用complement primer 25bp，而突變設計在中間

利用這組primer做完pcDNA3-A一整圈plasmid，大小約6.7kb

目前卡在PCR出來的產物很少很少，以致於做transform後都沒有colony長出來…

曾想過把多管PCR產物跑膠(先以DpnI digest)後，把少量的產物集中一起elution

但濃度還是很低(1.1 ng/ul)。

另外因此突變點位在基因末端(離stop codon約30bp,全長約1.4kb)，所以用下述方法

心想應該行不通

F1---------->                               F2--------->
      ------------------------------------------------------
      ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
      ------------------------------------------------------
                                            R1<---------
                                                        R2<----------

二段PCR產物overlap處為mutation site，不過會變成F1、R1夾出來1300多bp而F2、R2

夾出來可能100bp不到的產物，再將二個大小差距那麼大的產物加在一起覺得不太可行。


所以想請問版上有人遇過這種狀況嗎？

Primer重新order過了，Tm值60.XX，PCR用Phusion polymerase。

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.202.163
推 icome:跑膠再純會loss非常多 我都直接transform很少失敗
→ icome:成功率跟enzyme和competent cll品質有很大關係
推 anchi35:有做過1.3Kb+200bp的 也是類似的情形所以用vector的序列
→ anchi35:來做PCR 之後再重新接回
anchi35大，你是說把primer設計到vector中，離A基因的3'end有一段距離也可以囉？
→ blence:只要reaction及DpnI切完後,跑膠看得到隱約的band就會成功
→ blence:不須要purify或concentrate,因此5~10ul reaction是夠用的
blence大，你說的我做過，不過沒成功QQ 還是要多做幾次transform看能不能賽到一次XD
※ 編輯: nhxcyge         來自: 140.114.202.163      (11/11 21:24)
推 dodomilk:你是嫩嫩...？