請問大家ligation時ligase使用的量

[lier1986 (紫)]

前情題要

我在11月底有發了文想詢問cloning的相關事宜

那我目前的進展是

1.所有想要clone的gene，經PCR後，已經接到pGM-T上了。

(pGM-T是跟基隆米克斯買的，聽說是陸製的次等貨= ="；非invitrogen的pGEM-T)


2. competent cell的問題已經解決。

我自己做的competent cell轉型效率大概是10^5~10^6左右


現在是打算把pGM-T裡面的insert給切下，然後接到pET20b上

使用的RE為NdeI & HindIII

但是做了兩三次一直接不上去

RE的切割應該是沒問題的


我回頭去看其他人ligation的protocol

好像使用ligase的量都不太一樣

所以想問問各位 如果你們家用的ligase是NEB的

大概ligase的量都加多少呢?


(我看了一下NEB ligase的產品說明...

我好像每次做都加入400U的ligase 不知道這樣會不會太多= ="

我看TA cloning kit做ligation時 一次也才加3U的ligase...)

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◆ From: 140.122.198.1
推 dodomilk:兩個U是不一樣的 400 CELU (NEB) = 6 weiss units (別家)
→ dodomilk:我用NEB也是都做不出來 你可以試試看TA時用的ligase
→ dodomilk:我們家是用Fermentas的ligase啦，便宜又好用
推 puromycin:常見的0.5ul;少見的1ul﹐連到T上可以先測序看看有無問題
推 joseph103331:ligase應該是有就行 要不要考慮vector跟insert都切膠
→ joseph103331:純化? 這樣才能保證酵素切割都沒問題 還是已經做了XD
推 lyu0001:是沒有長菌嗎？
推 cji4cjp6:我實驗都加o.5ul TA用的+1