[求救]為何都測蛋白質濃度了,跑出的western band

[bigpobatin (pobatin)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出
實驗為測定核質分離的蛋白質濃度(細胞實驗),但每次測完蛋白質濃度,western跑完膠後,理當不同時間點未加藥之控制組的核內蛋白表現量應該一致,可每批細胞跑出來的表現量卻是不一致,internal control則和目標蛋白表現量的趨勢是一樣的,其也會受影響,
但沒有細胞質蛋白的汙染.不知道未什摸會這樣




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◆ From: 163.15.163.67
推 martyrtitan:重新定量一批吧 有可能是定量出錯了
→ martyrtitan:你的意思是internal control也會隨著給藥而有變化?
→ martyrtitan:你用的internal是 ?
推 mesenchymal:我猜是histone H1
→ mesenchymal:原PO的意思應該是希望不加藥的細胞不同時間點
→ mesenchymal:internal control 做出來要一樣? 測濃度的方式是?
推 leoblack:測蛋白質濃度本來就是參考~另外搞不好藥本身對internal
→ leoblack:control就有影響
推 supray:sample夠 也捨得花的話 個人覺得先跑一次Normalize再跑一次
→ supray:比較準-..-
→ bigpobatin:用BCA測定, 核內intrnal用過laminB, actin但都會受藥影
→ bigpobatin:收了很多次沒有加藥的控制組,於不時間點的蛋白
→ bigpobatin:但每一次測到的結果都不同,蛋白濃度測定也都準阿
→ bigpobatin:理論上控制組於不同時間下目標蛋白的表現量應該是一致
→ supray:破核的detergent有沒有超過BCA的容許濃度?
→ yuasa:load膠load的不準?定完量稀釋得不好?先看看藥對internal
→ yuasa:control的影響有沒有濃度相關性來決定是否是人為疏失造成的
→ bigpobatin:DTT算變性劑嗎? 主要是利用鹽離子濃度破細胞
→ bigpobatin:同一批樣品重複跑出來的結果是一致的,所以應該不是load
→ bigpobatin:不同次收的sample,跑出來的結果都不一樣
→ bigpobatin:其實不只是internal, 而是那整條lane的蛋白量都變少
→ bigpobatin:因為transfer完,會用Ponceau S染膜
→ bigpobatin:很明顯那整條lane蛋白都變少
推 lyu0001:要注意蛋白質濃度的偵測上限以及用BSA做標準曲線。
→ martyrtitan:我是用組織 會稀釋50x 且用lysis buffer當sample的blk
推 lyu0001:或是蛋白質transfer不完全