[求救] 有關site-directed mutagenesis

[god0430 (016)]

發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題

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板上各位前輩大家晚安~~~

小弟最近在作site-directed mutagenesis

但是一直遇到個問題....

跑完PCR後 會用Dpn 1在37度下切個一小時

然後跑Agarose Gel 確認一下大小~

跑出來的結果在預期的地方(6K)看不到band??

但是在1K那卻有Band??

這..到底是發生了什麼事??

是PCR沒有作到我要放大的基因嗎??

還是primer亂黏??

這樣我還需要transformation到DH-5 alpha嗎??

(感覺作了也長不出colony....~"~)

(小弟用的vector是pET30(約6K左右)；promoter是T7 promoter)



附上小弟的PCR的材料...

5uL     10xpfu buffer
1uL     Primer Forward
1uL     Primer Reverse
5uL     dNTP(因為放-20度C有點時間了~所以想說多加一點)
15uL    Plasmid(因為濃度有點低~所以才多放一點@@)
22uL    dd-water(滅過菌的)
1uL     pfu polymerase
------------------------------------------------------
Total   50uL


PCR的condition如下....

95度C Pre-heating

95度C 30秒

55度C 1分鐘

68度C 10分鐘(看protocol是寫1kb/mins)

共12cycle~


不知道板上的前輩們能不能給晚輩我一點建議...

或是有哪個步驟作錯了

(少加什麼?或不該加什麼?)

懇請給予小弟指導~~

拜託大家了  > <

謝謝~~~~~~



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.113.63.243
推 dodomilk:請把濃度也附上，另外12 cycle不會太少嗎？
→ dodomilk:你確定P出來的是1K嗎？ 還是primer dimer？
推 wensing:圖？
推 lyu0001:primer length and Tm?
推 vedali:TM時間用30秒就可了吧? 68度?不用72度跑6分鐘就好吧?
→ vedali:12cycle太少了25比較好
推 mandible:我覺得要看到很難ㄟ..坐坐看transformation吧!!
推 nhxcyge:總template量建議小於50ng，然後跑20-25個cycles看看
→ nhxcyge:Quikchange的product量較少，在DNA gel上不一定看得到產物