[求救] Western transfer

[martyrtitan (Martyrs)]

又是一個transfer的困擾了

我要看的是Microtubule associated protrein (MAP1B, MAP2)

這兩個蛋白質的MW大致為270 kDa左右

20% methnol 0% SDS 的transfer buffer (有預冷)

濕式 (hoefer 8*9cm^2) 450mA 2.5hr 和 3hr

膠體都有殘留 但我確定沒過頭(我墊兩張PVDF)

這次改用爬文的buffer條件

10% methnol 0.05% SDS (有預冷)

450mA 2.5hr

transfer的時候泡泡超多

transfer完我染膠和膜 兩個都沒有....(第二層PVDF也沒有)

我確定電極沒插反 (PVDF上有很糊的marker...)

請問各位前輩

是有什麼問題造成的呢？

補充：Total protein 37.5ug

      marker 5uL

另外請問一下..能Transfer到一半置換buffer嘛?

想說如果可以..buffer變溫後就換另一瓶冰的buffer (有包冰 也有預冷)


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◆ From: 140.112.98.129
※ 編輯: martyrtitan     來自: 140.112.98.129       (12/19 00:57)
推 FENOR:marker會很糊的話你transfer在設置的時候應該就有問題
→ FENOR:和protein大小無關
→ FENOR:270kDa的話要不要試試semidry?
→ martyrtitan:我們家只有濕式的
→ martyrtitan:之前用20% Methnol和SDS-free的buffer, marker很清楚
→ martyrtitan:這次我跑兩張 一張marker不見了 一張很糊
※ 編輯: martyrtitan     來自: 140.112.4.195        (12/19 10:10)
→ spears135:糊糊的話也有可能是過熱  放4度.......
這倒是有可能....
推 czyangshoo:也有可能是沒夾緊
有夾緊
推 leoblack:大kDa蛋白用wet比較好吧= ="~怎麼不試試100mA o/n?!
忘記所上有一間Cool room....
推 lyu0001:PVDF是有先浸潤過100％methanol or 95%ethanol for 5min?
有低
※ 編輯: martyrtitan     來自: 140.112.98.129       (12/20 12:57)
推 lyu0001:該不會是PVDF有問題？
→ lyu0001:我用400mA 1hr，就可以把170kDa轉過去。
推 bluecsky:連marker都湖就是條件有問題了,大Kda是會比較難轉過去
→ bluecsky:但是不可能會影響到你的marker,重新確認一次所有的條件
→ bluecsky:然後放冷房或冰箱跑,可以的話就用o/n的條件跑會更好
→ bluecsky:至於電流開多大就看你tank多大,然後去查一下就知道了
推 luhs:可能過熱的成分比較多