[求救] 以BL21 pET29a 方式表現蛋白

[hank578 (豪)]

第一次發文 請見諒

我是想要用pET29a insert 一段我想要表現的protein

pET29a 利用EcoRI, NotI 來切割

PCR product 同樣

DNA(plasmid)   1ug
RE10xbuffer    2ul
BSA          0.2ul
EcoRI,NotI   0.5ul*2
sH2O      to  20ul           37度 2hr   65度 15mins inactivation


pET29a 及PCR product 以RE切完 跑膠純化

以Nanodrop 測濃度 大約已pET29a:PCR=1:5 比例去做ligation overnight

接著加入 BL21 competent cell 約 5ul

冰上30mins

42度 heat shock

+SOC 1hr

塗在LB plate 含Kana (40ug/ml)

長出的菌我以 T7primer 去做colony PCR 都無法夾到


我是有推測出幾個問題

plasmid我以T7primer 去夾是OK的

沒有insert時回夾出300bp的大小

我ligation的plasmid都是7~800bp (表示insert是成功的)


BL21 competent cell 是我自己做的 (第一次做, 且實驗室沒人做過)

我一開始推測我的competent cell有問題

所以後來我有去用我們家買的commercial 的DH5alpha 將我做的plasmid送入

竟然沒長!



我會想要做這個方式是因為畢業的學長做過，但是聽說他是因為plasmid有問題

他也是try很久才做出來，我現在很confuse

plasmid用T7primer去夾 應該是是正確的

但是用兩種competent cell 都無法正常的transformation

有好心人可以指點嗎 卡一陣子了 很需要這個data= =



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc) 
◆ From: 140.120.209.85
推 leoblack:我以為ligation完後會先送到DH5alpha先amplify才送BL21
推 conective:你應該先確認ligation完東西的正確性 如果直接切pcr
→ conective:product一直不行 可試試看先作TA cloning
推 conective:另外切膠回收後NANODROP測的濃度是多少？最好跑膠看一下
→ conective:NANODROP在低濃度時有時會高估濃度 造成ligation有問題
推 dodomilk:我ligation的plasmid都是7~800bp  <= 不懂
→ conective:DH-5α沒長的話代表你原本ligation產物可能就有問題
→ dodomilk:但我猜你的restriction enzyme切不動pcr product
→ conective:要回歸基本面檢查切位跟PCR產物上的切位 不然再怎麼作
→ conective:都一樣 而不是勝任細胞的問題 你隨便拿個正常plasmid
→ dodomilk:建議同三樓，先作TA cloning再切，至少能確定有切下來
→ conective:去transformation(濃度ng級) 如果正常長代表勝任細胞沒
→ conective:問題 一個一個排除 但因為前人經驗plasmid有問題所以
→ conective:你應該先懷疑plasmid跟PCR產物 如果可以還是定序
推 leoblack:你的PCR產物切位是在端點嘛?!如果是~你恐怕要考慮這個網
→ leoblack:站 http://ppt.cc/kW,Q
推 leoblack:http://ppt.cc/Z8dT
→ hank578:好心人們可以站內信給我你們MSN嗎 直接問
→ lyu0001:要做positive and negative control。