[求救] RNA 的 純度太低 (大概1.0而已)

[jihher (jihher)]

大家好,

最近我第一次做RNA Extraction準備做real-time qPCR, 我用TRIzol的方法, 但是取出來
的RNA純度 0.9-1.0而已
我的方法是如下
細胞數 10^4 - 10^5 cells

1.  加 1ml Trizol , 室溫靜置5分鐘
2.  12,000 xg, 10min, 4'C, 抽上清液去新的tube
3.  加 0.2ml Chloroform, 用手搖晃15s, 室溫靜置3分鐘
4.  12,000 xg, 15min, 4'C, 抽分層後的上清液大約有600ul, 我取~400ul去新的tube
5.  加 0.5ml Isopropanol, 室溫靜置10分鐘
6.  12,000 xg, 10min, 4'C
7.  上清液倒掉, 留下白色的pellet
8.  加 1ml 75% EtOH, vortex 10s
9.  7,500 xg, 5min, 4'C, 上清液倒掉剩下大約20-30ul, laminar flow風乾10min
10. 加入20ul 的 RNase Free H2O 形成RNA原液, 55'C靜置10分鐘, 保存在-80'C
11. RNA原液抽部分稀釋100X & 10X, 去看吸光值A260/A280

問題是 A260/A280 = 0.9-1.0 , 我全程在laminar flow進行
不知道是不是細胞數太少的原因  還是中間過程漏了甚麼重要的步驟 ??


謝謝大家 !!!



發問時請注意，若是要問實驗相關的問題，請將實驗的步驟、所用的條件大致列出

以方便板友幫您追蹤問題

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.114.51.248
推 dodomilk:我沒有作步驟2.但我想應該不會有差
→ dodomilk:為什麼要作步驟11.呢？ 這樣濃度不是變超低嗎？
→ dodomilk:每ul應該只剩不到100ng吧？
→ saviora:第4步沒吸到白色的東西吧
沒, 因為我才抽2/3的上清液
→ saviora:第11步應該不是全部拿去稀釋
※ 編輯: jihher          來自: 140.114.51.248       (12/23 14:09)
推 icome:不是吸到蛋白就是酒精殘留 這數值蠻誇張的
→ icome:那你吸光值多高 濃度太低數值太低根本不可信
稀釋100x的OD值回約0.04左右, 所以原液再取一些稀釋10X的OD有0.2
但是 比例還是一樣, 酒精是用倒的還是用吸的? 殘留影響那麼大?
廠商是覺得我細胞數太少
※ 編輯: jihher          來自: 140.114.51.248       (12/23 14:25)
→ f9361046:我沒做2和11
推 icome:換算一下你的RNA濃度只有160ng/ul... 細胞種多一點吧
推 icome:細胞數至少提高十倍 一般抽出來都有1-2ug/ul的濃度
→ huuban:是什麼物種的細胞？有沒有跑膠圖？
→ datro:第二步的目的是? 我從來沒做過第二步 直接加1/5氯仿 混勻離
我的是生醫材料, 第2步是為了把材料去掉
→ datro:心 第二步應該是 phenol/choloform的步驟吧
感謝大家 !! 後來是OK了
不過有一組RATIO是2.16, 這樣還是可以跑qPCR嗎?
※ 編輯: jihher          來自: 140.114.202.191      (12/24 01:15)
→ huuban:所以後來是怎麼解決的呢？
→ keepseaching:260/280的比值低應該是RNA有降解的現象
→ keepseaching:不過有時吸光值只是參考 最好跑個膠檢測看看
推 icome:超過2可能有降解 跑膠看看