[求救] transfection efficiency (Huh-7)

[GanLinBa (Fait votre père)]

不管怎做都只接近50%

但希望能更高一點 能達到70%

我的方法:

3cm dish 5*10^5/3 ml growth medium

1. opti(92 ul) + lipofectamin 2000 (8 ul), RT 5 mins => A eppendrof

2. add opti (97 ul) + EGFP (3 ul) into A eppendrof, RT 20 mins => B eppendrof
   (total volume = 200 ul)

3. remove medium and wash for dish

4. add 800 ul into B eppendrof => C eppendrof (dilute toxicity)
   (total volume = 1 ml )

5. add 2 ml growth medium and C eppendrof into 3cm dish

4. incubate 24 hrs

因為Huh-7很難transfect 所以才用24小時(48小時我也試過)

而不是opti transfect 6hrs後把opti含有lipo倒掉再換growth medium

(我曾經試過 但因為換growth medium 而細胞會繼續長)

但是理論上GFP應該算蠻簡單吃進去

請問我哪裡步驟需要更改會比較好

但我去算時大約都才接近50%

還是要只用opti transfect 6小時後 不要倒掉再加growth medium會比較好?

感謝

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                 有妳們在的風景,永遠是我心底最最美好的詩句
                        相逢如絮紛飛,飄揚卻也沉落的夢妳好正願意嫁給我嗎
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※ 編輯: GanLinBa        來自: 115.43.213.75        (01/11 02:30)
※ 編輯: GanLinBa        來自: 115.43.213.75        (01/11 02:38)
推 vancent:電的考慮嗎?
推 arlix:DNA的濃度?
→ GanLinBa:電的可能不考慮 DNA 1060 ng/ul
→ xenosdk:換一個transfection reagent試試看? fugene 6/fugeneHD
→ xenosdk:還有就是如果你細胞能長時間承受serum starvatio
→ xenosdk:serum starvation*, 就不要加growth medium,直接incubate
→ xenosdk:24h, 或是加少量serum的medium.. 或是加2ml opt/w x%serum