[求救] 又是ligation

[ennnnno (伊諾)]

大家好~
又是ligation的問題要麻煩大家了
這次是學妹遇到麻煩了

vector:8k多
insert:一共有四組,有兩組700多bp,一組800多bp,一個200多bp
compentent cell:DH5α (不過是自己做的)
restriction enzyme:NcoI (單點切)

vector用酵素切完後,會用CIP處理
從膠上切下來,用kit純化,回溶在水中
切的時間4hr以上或是overnight都有

insert切完之後,也是用kit純化
之後回溶在水中
切的時間同vector

之後做ligation 16度,overnihgt
V:I的比例是跑膠後,學長會給建議
所以比例都不太一定
然後transform

但是做不出來


之後再接到TA上
從TA上把insert切下來
但這裡有一個問題
TA clone的plasmid都是用傳統法抽的
濃度也都蠻濃的
之後用酵素切一切,不知道為什麼回收後的濃度都很淡

和vector進行ligation(比例一樣聽學長建議),結果一樣失敗


反覆做了幾次,都接不上去
可以請教各位版友,還有沒有什麼神技呢??
謝謝~



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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.94.249
※ 編輯: ennnnno         來自: 140.116.94.249       (02/07 16:41)
推 conective:1.勝任細胞測過效率嗎 差1-2個log就決定有沒有colony
→ conective:2.insert回收濃度多少 有跑過電泳確認嗎
→ conective:3.V：I比例多少？ 學長建議是什麼條件
1.勝任細胞效率10的六次
2.insert回收濃度都很淡,直接跑膠check,幾乎是快看不見的那種 (load1μl)
3.v:I我就不清楚了,學長是依跑膠後的亮度去看的

推 leoblack:ligase是哪家的?!
ligase 是NEB的

→ conective:4.作不出來是指都沒有菌落還是挑起來再抽都不是接好的
有時候都沒長,但有長的也挑不到= =

→ conective:5.有作自接的control嗎？
自接的control是沒做...

※ 編輯: ennnnno         來自: 140.116.94.249       (02/07 18:16)
→ lyu0001:check E.coli competency at leat 10^5/microgram plasmid
→ noble019:ligation buffer確定一下ATP還有沒有效率
→ noble019:重複冷凍解凍常會失效.換一罐buffer試試看
→ qumai:提高DNA的濃度吧
推 kingbar:建議試試看用KIT抽的plasmid做酵素剪切吧~我也曾經遇過用
→ kingbar:傳統法抽的去切，雖然plasmid原始濃度比較高，但切完回收
→ kingbar:效率就是比較低...
推 kingbar:還有依我自己的經驗，這種有可能自接的ligation，insert比
→ kingbar:例要比普通ligation要高一點，成功機會比較高。
→ ennnnno:謝謝K大~
推 bluecsky:傳統法抽的plasmid其實純度比較差 不然kit怎麼賣..