[求救] 真菌transform的方法

[peggie0903 (dwz.tw/57pn)]

大家好 我最近在做Aspergillus的transformation

大致上是將孢子隔夜培養後

再用vino taste酵素處理兩小時 去除細胞壁 得到protoplast

之後再用1.2M sucrose為底 上層放培養液去離心

理論上protoplast應該會出現在培養液跟蔗糖的介面

但是我就是無法看到那明顯的分層.......

已經困擾很久了 拿不到protoplast的話就無法進行transform

可不可以請有經驗的版友 提供我真菌transform的方法？

或是提供一些意見

感謝大家了

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※ 發信站: 批踢踢實業坊(ptt.cc)
◆ From: 140.116.72.196
推 Ianthegood:一開始做gradient有分層嗎?這不是有機喔 一開始沒有
→ Ianthegood:明顯分層的話離完也不會有
→ peggie0903:"一開始有分層" 是要先離心的意思嗎?
我好像有點理解錯誤

以下是我follow的PAPER

We normally do this by layering the protoplasting mixture gently onto
a sterile 1.2 M sucrose cushion in a sterile, capped centrifuge tube (Sarstedt, cat. no. 62.547.004) and centrifuging at 1,800g
for 10 min at 4 °C in a swinging bucket rotor.

蔗糖應該只是在下面 不需要梯度的樣子
※ 編輯: peggie0903      來自: 210.59.89.52         (02/21 18:20)
→ Ianthegood:用針筒把sucrose很慢很慢很慢平順的一口氣放到最底
→ Ianthegood:就會看到有一層漂亮的分界